小鼠Dlk1-Dio3结构域母源印记的调控机制

《Nature Communications》：Regulatory mechanisms of maternal imprinting at the murine Dlk1-Dio3 domain

　　

基因组印记是一种表观遗传过程，导致基因根据亲本来源特异性表达。Dlk1-Dio3结构域是最大的印记基因簇之一。尽管印记控制区（ICR）内的基因间CpG岛（IG-CGI）上的DNA甲基化控制来自父源染色体的表达，但调控未甲基化母源染色体的机制仍不清楚。在ICR的转录调控元件（IG-TRE）中，缺失实验在体外鉴定出一个同时具有沉默和增强活性的最小区域，其中SOX2和ZFP281有助于母源染色体上的增强子功能。然而，在体内，该缺失并未影响小鼠胚胎中的母源表达；反而在两个亲本染色体上激活了Dlk1。将该IG-TRE缺失与致死的IG-CGI缺失相结合，通过平衡Dlk1表达挽救了小鼠的致死性，尽管母源基因持续上调。这些结果表明，该结构域的表达缺失比表达增加更有害，突显了体内分析的重要性。在未甲基化母源染色体上鉴定出活性调控因子，挑战了印记主要是一种甲基化驱动现象的主流观点，进一步揭示了控制印记的复杂层级机制。

**论文解读：小鼠Dlk1-Dio3结构域母源印记的调控机制**

基因组印记是一种表观遗传过程，使基因根据亲本来源特异性表达。Dlk1-Dio3结构域是哺乳动物中最大的印记基因簇之一，在小鼠和人类中高度保守，其异常印记可导致胚胎致死或人类Temple综合征和Kagami-Ogata综合征。该结构域的印记受种系来源的基因间差异甲基化区域（IG-DMR）调控。IG-DMR包含两个功能元件：一个为IG-CGI，在父源染色体上甲基化并通过ZFP57维持抑制状态；另一个为IG-TRE，推测在未甲基化的母源染色体上发挥增强子功能，但其体内作用机制此前尚不明确。已有研究表明，母源缺失整个IG-DMR导致母源染色体父源化，而父源缺失IG-CGI则导致父源染色体母源化，提示IG-TRE可能独立于CpG岛调控母源表观基因型。然而，IG-TRE内部的具体功能元件及其在发育过程中的作用仍不清楚。为此，研究人员开展了系统的体外功能剖析和体内基因敲除研究，以解析IG-TRE调控母源印记的分子机制。

研究人员首先通过双荧光素酶报告基因检测系统，在mESCs中对IG-DMR进行系统性分段，鉴定出具有启动子样活性的最小区域；随后利用CRISPR/Cas9技术在C57BL/6J×CAST/EiJ杂交mESCs中删除IG-TRE或特定转录因子结合位点，结合SNP分析等位基因表达和甲基化状态；并建立了C57BL/6J背景的IG-TREΔ550敲除小鼠，与CAST/EiJ杂交获得亲本特异性缺失的后代，在胚胎E15.5和成年9周阶段进行分析。主要技术包括：荧光素酶报告实验、CRISPR/Cas9基因编辑、染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）、等位基因特异性表达分析（焦磷酸测序SNP分析）以及DNA甲基化焦磷酸测序。样本来源包括杂交mESCs、E15.5胚胎脑/肝/胎盘和成年脑/肝组织。

**IG-DMR的体外功能剖析**：通过将6.125 kb IG-DMR分为四个重叠片段进行荧光素酶检测，发现1.2 kb的Mid片段具有启动子样活性，进一步细分后确定724 bp片段是有效正调控的最小区域。

**体外删除IG-TRE导致母源表观基因型失调**：在mESCs中母源删除1.3 kb IG-TRE或仅315 bp区域，均导致Gtl2、Rian和Mirg表达显著下降，且Gtl2-DMR甲基化升高；父源删除无影响，表明IG-TRE正调控母源染色体上的基因表达。

**SOX2和ZFP281结合IG-TRE控制母源基因表达**：在315 bp区域内分别删除SOX2或ZFP281结合位点，母源染色体上基因表达降低、甲基化升高，而父源删除无效应，证明这两个转录因子是母源表观基因型维持的关键调控因子。

**315 bp最小区域具有增强子功能，相邻235 bp区域具有沉默功能**：荧光素酶实验显示，315 bp片段在报告基因中表现出增强子活性，且该活性依赖SOX2结合；而下游235 bp片段则表现出沉默活性；550 bp组合片段呈现部分增强功能，说明IG-TRE内存在增强与沉默双重对立调控元件。

**母源ZFP281结合依赖于SOX2，二者共同调控母源染色体表达**：ChIP-qPCR显示，mESCs中SOX2在两条亲本染色体上均有结合，而ZFP281仅母源特异性结合；删除母源SOX2位点导致ZFP281结合丧失，而删除ZFP281位点不影响SOX2结合，表明SOX2是ZFP281上游调控因子。

**生成IG-TRE敲除小鼠**：研究人员创建了删除550 bp IG-TRE（包含315 bp增强区和235 bp沉默区）的敲除小鼠，用于体内功能验证。

**成年小鼠中IG-TREΔ550的表型和印记效应**：母源或父源杂合缺失小鼠均存活且可育，9周龄时体重和体长与野生型无差异。母源缺失成年脑中Dlk1母源表达显著增加，Gtl2、Rian和Mirg表达下降；父源缺失无变化。甲基化水平正常，表明IG-TRE功能具有组织特异性。

**胚胎发育期间IG-TREΔ550的组织特异性剖析**：E15.5胚胎母源缺失导致胚胎变小，脑中Dlk1表达从两条染色体均增加，但母源基因表达无变化；父源缺失无表型。说明胚胎期IG-TRE主要发挥抑制Dlk1的作用，而非增强母源基因。

**SOX2和ZFP281在体内成年脑中结合母源IG-TRE**：ChIP-qPCR显示，两者在9周脑组织中结合较强，在E15.5胚胎脑中结合很弱，且主要结合母源染色体；母源IG-TREΔ550缺失后结合消失，解释了成体与胚胎阶段的功能差异。

**结合两种IG-DMR缺失模型平衡Dlk1基因剂量**：将母源IG-TREΔ550（Dlk1表达增加）与父源IG-CGI缺失（Dlk1表达缺失）相结合，用于检测Dlk1剂量平衡是否足以挽救致死性。

**IG-TREΔ550和IG-CGIΔP双缺失幼崽的存活**：单独父源IG-CGI缺失导致出生后致死，但双缺失幼崽可正常存活，整体与野生型无明显差异。

**双缺失胚胎的印记分析**：E15.5双缺失胚胎脑中Dlk1表达恢复至正常水平，但Rtl1仍低表达，母源基因仍高表达，表明恢复Dlk1表达足以挽救父源IG-CGI缺失的致死性，而母源基因持续上调并不致命。

讨论部分指出，体外与体内结果存在明显差异，IG-TRE的功能具有时间和细胞类型特异性。SOX2和ZFP281在成年脑中结合IG-TRE，但在胚胎脑中结合微弱，导致不同发育阶段缺失效应不同。IG-TRE缺失还引起Dlk1从两个亲本染色体表达，提示该元件参与跨等位调控。双缺失实验表明，Dlk1的表达缺失比过表达更有害，精确的基因剂量平衡对正常发育至关重要。研究结论可概括为：该工作细化了Dlk1-Dio3结构域的调控图谱，鉴定出IG-TRE处的转录因子相互作用以及增强子和沉默子元件；提供了顺式调控元件在该区域存在表观遗传冗余的体内证据，并强调了体内模型对于解析建立和维持印记基因表达所需的复杂表观遗传事件链的必要性。该研究挑战了印记主要由DNA甲基化驱动的传统观点，揭示了母源染色体上活性调控因子的重要功能。