Zfp57与Gzf1的互逆、甲基化依赖性结合在发育重编程中守护Dlk1-Dio3印记

《Nature Communications》：Reciprocal, methylation-dependent binding of Zfp57 and Gzf1 safeguards Dlk1-Dio3 imprinting during developmental reprogramming

　　

基因组印记通过印记控制区（ICR）的差异DNA甲基化确保亲本特异性基因表达。然而，未甲基化等位基因如何抵抗从头甲基化仍不清楚。研究人员利用等位基因特异的Dlk1-Dio3 ICR甲基化报告系统和全基因组功能缺失筛选，鉴定出锌指蛋白GZF1，其结合未甲基化的母源ICR，并通过含有GZF1和ZFP57基序的调控元件介导互斥的、甲基化依赖性结合，从而保护该位点免受从头甲基化。任一因子缺失均导致互逆的印记失败：Gzf1缺失诱导母源等位基因甲基化、H3K4me3耗竭及母源转录本沉默，而Zfp57缺失导致母源化。值得注意的是，GZF1在卵母细胞和胚胎中均保护未甲基化ICR免受从头甲基化，其缺失导致围产期死亡，与母源等位基因的父源化一致。总之，这些发现建立了一种互逆机制，在印记建立和胚胎重编程过程中维持亲本表观遗传不对称性。

研究背景与立项依据

基因组印记（genomic imprinting）依赖配子发生期建立的亲本特异性差异甲基化区（DMR），即印记控制区（ICR），在受精后全局去甲基化浪潮中抵抗重塑，保障胚胎发育所需基因剂量。已有研究明确ZFP57等KRAB锌指蛋白识别甲基化六核苷酸、招募TRIM28（KAP1）与SETDB1沉积H3K9me3，维持父源甲基化ICR稳定；但未甲基化母源等位基因如何在植入后DNMT3A/B介导的从头甲基化波中受保护，机制长期未明，尤其在父源印记Dlk1-Dio3位点的IG-DMR（intergenic DMR）上缺乏在体证据。Dlk1-Dio3域约1 Mb，其IG-DMR含5′ CpG岛（IG-CGI）与下游低CpG密度转录调控元件（IG-TRE），母源IG-CGI未甲基化、父源甲基化，母源缺失致父源化表型与围产期致死。为无偏鉴定守护未甲基化等位基因的trans因子，研究人员以该位点为核心开展机制解析。

主要技术方法概览

研究构建F1（129×CAST）小鼠胚胎干细胞（mESC）双色甲基化敏感Snrpn启动子报告系统（tdTomato示母源未甲基化、GFP示父源未甲基化），进行全基因组CRISPR/Cas9功能缺失筛选（Brie gRNA文库，每基因4 gRNA，传代6次后分选Tom⁺GFP^?/Tom⁺GFP⁺/Tom^?GFP^?亚群测序）；结合靶向敲除（KO）、双敲（dKO）、Tet三敲（tKO）株系，亚硫酸氢盐扩增子测序与NGS、RNA-seq、ChIP-seq（内源及Flag标签GZF1）、ChIP-qPCR、CUT&Tag（H3K4me3）、蛋白结合微阵列（PBM，评估TACGGTA基序甲基化敏感性）、Co-IP/MS鉴定互作蛋白；在体部分通过受精卵CRISPR切除Gzf1 exon3建系，分析E10.5/E13.5–15.5胚胎、围产及存活幼鼠、P25体重、MII卵母细胞纳米孔长读长甲基化；样本队列含mESC系、胚胎 trunks、成年组织及雌鼠卵母细胞。

研究结果

A CRISPR screening platform to identify putative trans-regulators of the IG-CGI

研究人员建立IG-CGI双报告mESC平台，Dnmt1 KO验证被动去甲基化致GFP激活，确认系统可捕获等位甲基化动态，用于高通量筛选。

Genome-wide loss-of-function screen recovers core regulators of IG-CGI methylation

全基因组KO筛选Tom⁺GFP⁺群富集Zfp57、Uhrf1、Dnmt1，单基因验证Dnmt1敲除激活父源GFP；证实已知甲基化维持通路可被回收。

Gzf1 and Qrich1 are candidate regulators of the unmethylated IG-CGI allele

Tom^?GFP^?群（母源高甲基化）富集分析获Gzf1与Qrich1，单KO分别致~54%与23%双阴偏移；Tet家族未富集，指向Gzf1为序列特异性守护因子。

Gzf1 loss paternalizes the Dlk1-Dio3 maternal allele, whereas Tet enzymes are dispensable

Gzf1-KO克隆沉默母源Tom，亚硫酸氢盐测序示IG-CGI高甲基化（未达满甲基，暗示冗余因子），IG-TRE与Gtl2-DMR同步高甲基化，Gtl2/Rian/Mirg表达下调，EB分化后Dlk1由单等位转双等位表达；Tet-tKO甲基化与表达均近野生型，排除Tet主动去甲基化主导说。5-氮杂胞苷擦除后Gzf1-KO细胞重甲基化加速，WT双阳细胞撤药后稳定，证明GZF1在DNMT复燃时阻断从头甲基化。

GZF1 binds unmethylated TACGGTA sequences at the IG-DMR

ChIP-seq定位GZF1结合于IG-CGI上游~440 bp（GZF1-BS），F1 SNP分析显示仅结合未甲基化母源（129）等位，Dnmt1-KO后转双等位。PBM获共识回文TACGGTA（含CpG），甲基化探针结合显著减弱，株系多态无关；Gzf1回补已甲基化KO细胞不重启报告，切除GZF1-BS致母源缺失双阴表型，确认序列与甲基化双重依赖。

Gzf1 and Zfp57 facilitate distinct epi-allelic states at the IG-DMR

GZF1-BS并存ZFP57 motif TGCCGC，ZFP57 ChIP-qPCR富集~10倍；Zfp57-KO与Zfp57-Gzf1-dKO均致IG-CGI低甲基化及母源基因上调，表明Zfp57为甲基态顶层稳定者，无Zfp57时Gzf1-KO所致甲基化无法固化。CUT&Tag示Gzf1-KO丢失GZF1-BS/IG-CGI/Gtl2-DMR的H3K4me3峰；Co-IP/MS获互作候选KDM3A（H3K9去甲基酶）与QRICH1，提示GZF1借活性染色质环境（H3K4me3高、抑DNMT3）护位。

Genome-wide analyses in mESCs reveal limited effects of Gzf1 outside the Dlk1–Dio3 locus

RNA-seq显示mESC全局转录近WT，仅少数基因（含Gtl2）轻度下调；全基因组1110个GZF1峰推回TACGGTA，不富集旧报GRE（TGCGCGTCTATA）或重复序列，支持该因子在Dlk1-Dio3外呈位点特异性转录调控，非全局表观开关。

Gzf1 loss causes maternal allele paternalization and perinatal lethality in mice

受精卵打靶获Gzf1-KO系，E13.5–15.5合子比例正常；E10.5胚胎trunk中IG-CGI、Gtl2-DMR、IG-TRE高甲基化，Gtl2/Mirg/Rian下调、Dlk1翻倍，复刻mESC父源化。出生后纯合子显著耗减（围产期致死），偶存个体P25/P50生长迟缓，IG-CGI全甲基化而Gtl2-DMR中间甲基化；死产P1纯合子IG-CGI高甲基化，印证母源父源化致死。

Gzf1 safeguards the IG-DMR from de novo methylation during oogenesis

纯合KO雌鼠MII卵母细胞纳米孔测序示IG-CGI整体高甲基化但卵间异质；KO雌×WT雄子代窝数减小，存活杂合子体重与甲基化近WT，表明卵源（母效）不完全甲基化可被父源Gzf1挽救，证明Gzf1在卵发生期与胚胎期双重守护未甲基化母源ICR。

讨论与结论翻译

研究界定GZF1为序列与甲基化敏感因子，在IG-CGI上游~440 bp元件与ZFP57呈互斥结合：ZFP57识甲基化TGCCGC，召TRIM28/SETDB1/H3K9me3固父源；GZF1识未甲基化TACGGTA，偕KDM3A、QRICH1及H3K4me3促许可染色质、阻DNMT3。Gzf1缺失允IG-CGI从头甲基化，转ZFP57可结合态，一旦甲基化固化则GZF1不可重结合；Zfp57缺失则父源去甲基化母源化；DNMT1缺失双等位GZF1结合，DNMT复燃后被GZF1挡回低甲基。Tet三敲不扰中间甲基化，否定Tet主导说。该互逆、甲基化依赖模型在《Nature Communications》发表，阐明Dlk1-Dio3在印记建立与胚胎重编程两阶段亲本表观不对称性的守护机制，为父源ICR在卵中抗甲基化提供类比框架，并将GZF1由报道的转录抑制子重构为该位点母源等位激活样守护者。