GPNMB促进PEDV感染期间双膜囊泡积累并促进结构蛋白转运

《Virulence》：GPNMB promotes double-membrane vesicle accumulation and facilitates structural protein transport during PEDV infection

　　

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）在全球养猪业中造成重大经济损失。调控PEDV胞内复制，尤其是早期RNA合成和结构蛋白产生的宿主因子尚未被充分理解，这限制了抗病毒策略的开发。研究人员报道，黑色素瘤非转移性糖蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，GPNMB）是促进PEDV感染的关键宿主因子。GPNMB最初被鉴定为PEDV S1结合伴侣，通过Vero和IPEC-J2细胞中的功能缺失与功能获得实验，研究人员确认其增强感染。GPNMB的基因敲除抑制了PEDV复制，但不影响病毒吸附或内化。研究人员证明，GPNMB是双膜囊泡（double-membrane vesicles，DMVs）积累所必需的，并促进早期病毒RNA合成。值得注意的是，GPNMB直接与PEDV刺突（spike，S）蛋白和核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白相互作用，增加其丰度，并促进其从内质网（endoplasmic reticulum，ER）到高尔基体的运输，表明其参与结构蛋白成熟。该研究揭示了GPNMB在PEDV复制中的关键作用，并将其提名为宿主导向抗病毒干预的靶点。

**论文解读：GPNMB作为PEDV复制的关键宿主因子——促进双膜囊泡积累与结构蛋白转运**

**一、研究背景与科学问题**

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是一种直径为95–190 nm的有囊膜病毒，属于冠状病毒科（Coronaviridae）甲型冠状病毒属。其基因组约28 kb，包含七个开放阅读框（open reading frames，ORFs），编码非结构蛋白（nsp1–nsp16）以及刺突（spike，S）、囊膜（envelope，E）、膜（membrane，M）和核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白等结构蛋白，另含辅助蛋白ORF3。PEDV于20世纪70年代在英国首次出现，随后在欧洲多国及泰国等地成为地方性流行或散发性疾病。近年来，高致病性变异株的频繁出现对养猪业构成持续挑战，亟需新的治疗干预手段。

PEDV复制始于病毒进入，由S蛋白与宿主受体结合驱动。S1亚基包含N端结构域（S1-NTD）和C端结构域（S1-CTD），分别介导与聚糖和蛋白受体的结合。进入后，病毒基因组被翻译加工为非结构蛋白，驱动双膜囊泡（double-membrane vesicles，DMVs）的形成。复制转录复合体（replication and transcription complex，RTC）装配于DMVs上启动RNA合成，通过不连续转录产生全长基因组RNA和嵌套的亚基因组RNA（subgenomic RNAs，sgRNAs）。sgRNAs指导亚基因组mRNA（sg mRNAs）的合成，启动结构蛋白的产生。与宿主分泌蛋白类似，病毒结构蛋白需经内质网（endoplasmic reticulum，ER）和高尔基体加工后才进行病毒体组装和释放。尽管已鉴定出若干参与PEDV进入的宿主因子，但调控其胞内复制，尤其是控制RNA合成和结构蛋白生物发生的调控因子，仍知之甚少。

GPNMB（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B）是一种高度保守的I型跨膜糖蛋白，参与免疫调节、组织修复和癌症进展等多种生理与病理过程。在细菌感染中，GPNMB通过损害SNARE复合体干扰自噬体-溶酶体融合，从而促进麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）的胞内生存。在病毒学领域，其作用鲜有探索。至今仅研究过两种猪病毒：在猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染中，GPNMB抑制自噬体-溶酶体融合并减弱病毒复制；在猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）感染中，其结合病毒ORF5蛋白、上调细胞周期蛋白A、驱动S期进入并抑制病毒复制。因此，GPNMB在这些系统中似乎发挥抗病毒活性，但在PEDV等冠状病毒感染中的功能仍有待阐明，亟需系统研究。

**二、研究目的与重要发现**

本研究将GPNMB鉴定为PEDV S1的宿主膜蛋白结合伴侣，并通过功能实验证实其为Vero和IPEC-J2细胞中病毒复制所必需的促病毒因子。研究人员证明，GPNMB促进病毒RNA合成和DMV积累，直接结合病毒结构蛋白S和N，并促进其表达及ER-高尔基体转运。这些发现确立了GPNMB作为PEDV新型宿主依赖性因子的地位，并凸显其作为宿主导向抗病毒策略靶点的潜力。该论文发表于《Virulence》。

**三、主要关键技术方法**

研究使用了多种关键技术手段：通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定S1结合蛋白；运用共免疫沉淀（co-IP）和激光共聚焦显微镜验证蛋白互作与共定位；采用CRISPR-Cas9技术构建GPNMB基因敲除（knockout，KO）Vero细胞系；利用小干扰RNA（siRNA）在Vero和IPEC-J2细胞中进行基因敲低；通过透射电子显微镜（TEM）观察DMV形成；使用商品化富集试剂盒分离ER和高尔基体组分；采用RT-qPCR、蛋白质印迹（IB）、免疫荧光（IFA）、TCID50病毒滴定等手段进行定量分析。研究涉及的细胞系包括非洲绿猴肾细胞（Vero）、猪肠上皮细胞（IPEC-J2）和人胚胎肾细胞（HEK-293T）；病毒株包括CH/Hubei/2016（GenBank：KY928065.1）和DR13（GenBank：JQ023162）。

**四、主要研究结果**

**（一）GPNMB表达在PEDV感染期间发生动态失调**

为鉴定促进PEDV感染的宿主因子，研究人员通过质谱（MS）鉴定与PEDV S1蛋白相互作用的蛋白。在候选蛋白中，病毒感染中功能不明的GPNMB被优先用于机制探索。在Vero细胞中感染PEDV（MOI=1）后，于3、6、9、12、24和36小时感染后时间点（hpi）收集样本。结果显示，GPNMB mRNA水平从24 hpi起显著上调，而其蛋白水平则显著下降。这种差异模式提示PEDV感染可能激活GPNMB基因表达，但蛋白水平的下降可能源于病毒或宿主在转录后或翻译水平的调控。

**（二）GPNMB促进Vero和IPEC-J2细胞中PEDV感染**

通过siRNA敲低Vero细胞中内源GPNMB，PEDV RNA丰度降低约58%，N蛋白水平降至约53%；反之，过表达GPNMB使病毒RNA丰度增加148%，N蛋白水平增至约170%。在IPEC-J2细胞中，两条siRNA敲低GPNMB后，PEDV RNA分别减少约52%和37%，N蛋白分别下降约87%和76%；过表达GPNMB则使病毒RNA丰度增加约196%，N蛋白水平升高约152%。利用CRISPR-Cas9构建的GPNMB-KO Vero细胞系感染PEDV后，病毒N蛋白水平（尤其在感染早期）、子代病毒滴度（下降约1.1 log₁₀TCID₅₀/mL）和感染力（IFA检测下降约83%）均显著低于野生型（WT）对照。将GPNMB重新导入KO细胞可恢复病毒复制，N蛋白水平呈剂量依赖性升高，病毒滴度回升约1.2 log₁₀TCID₅₀/mL，感染力增加约355%。功能缺失和功能获得实验共同确立GPNMB为Vero和猪源IPEC-J2细胞中PEDV感染的正向调节因子。

**（三）GPNMB与PEDV S1亚基的C端结构域（CTD）相互作用**

在PEDV感染的Vero细胞中，内源co-IP和共聚焦显微镜实验证实GPNMB与病毒S蛋白存在相互作用和共定位。在HEK-293T细胞中的外源共转染实验也验证了GPNMB与PEDV S蛋白的共定位。进一步构建S1的两个截短体（HA-Fc-NTD和HA-Fc-CTD）进行双向co-IP，结果显示CTD而非NTD能够有效沉淀GPNMB；反之，GPNMB也选择性捕获CTD。这些数据表明GPNMB特异性结合PEDV S1亚基的CTD。

**（四）GPNMB对PEDV吸附和内化非必需**

在4°C条件下将GPNMB-KO和WT Vero细胞与PEDV（MOI=5）孵育2小时以检测病毒吸附，RT-qPCR、TCID₅₀滴定和共聚焦显微镜结果均显示两种细胞系间结合病毒量无显著差异。IPEC-J2细胞中敲低GPNMB亦不影响病毒吸附。内化实验方面，4°C吸附2小时后转移至37°C 1小时允许病毒进入，RT-qPCR和病毒滴定显示GPNMB缺失不影响两种细胞中的PEDV内化。此外，感染后30分钟检测病毒与早期内体标志物EEA1的共定位，GPNMB敲除未改变PEDV进入EEA1阳性早期内体的效率。这些发现排除了GPNMB在PEDV吸附和内吞阶段的作用，提示其在病毒生命周期的进入后阶段发挥功能。

**（五）GPNMB是PEDV早期感染阶段有效复制所必需的**

首先确定PEDV在Vero细胞中的第一个复制周期：病毒RNA水平在4 hpi开始上升，N/S蛋白在7 hpi首次可通过免疫印迹检测，感染性子代病毒于7 hpi出现在上清液中，据此确定第一个复制周期持续至7 h。在Vero细胞中，GPNMB敲除使单周期内PEDV RNA减少约53%，子代病毒滴度下降约1.34 log₁₀ TCID₅₀/mL，N和S蛋白水平分别降低约69%和49%。在IPEC-J2细胞中敲低GPNMB获得一致结果：病毒RNA减少约87%（siRNA1）和91%（siRNA2），N蛋白分别下降约78%和75%，S蛋白下降约67%和54%。值得注意的是，GPNMB缺失的抑制效果在第一个复制周期内比多周期感染更为明显，表明GPNMB主要在感染早期发挥功能。

**（六）GPNMB促进PEDV DMV积累以支持病毒复制**

冠状病毒劫持宿主内膜系统生成DMVs作为病毒RNA复制的场所。免疫荧光实验显示，在4 hpi时dsRNA与GPNMB存在显著共定位。透射电镜（TEM）观察感染细胞（MOI=1）在4和6 hpi的DMV数量，GPNMB-KO细胞中DMV数量较WT对照显著减少。与复制区室积累受损一致，KO细胞在4 hpi时基因组RNA（gRNA）和N mRNA水平均显著低于WT。这些数据表明GPNMB通过支持DMV积累来调节PEDV早期RNA复制。

**（七）GPNMB促进PEDV结构蛋白S和N的成熟**

在GPNMB-KO细胞中转染递增剂量的GPNMB质粒，S和N蛋白的mRNA及蛋白水平均呈剂量依赖性上升。在较低剂量（<0.4 μg）时，蛋白水平显著增加而mRNA水平未变，提示GPNMB在转录后水平发挥作用。co-IP实验证实GPNMB也直接与N蛋白相互作用。利用ER标志物Calnexin和高尔基体标志物GM130进行亚细胞组分分离实验，GPNMB表达使ER中S蛋白水平降低而高尔基体中S蛋白水平升高；N蛋白在ER中呈现轻微减少，在高尔基体中增加但幅度略低于S蛋白。在感染条件下，过表达GPNMB同样促进内源S和N蛋白从ER到高尔基体的重新分布。这些结果表明GPNMB促进S蛋白和N蛋白从ER向高尔基体的转运，可能有助于其翻译后修饰。

**五、讨论与结论**

本研究首次确立了GPNMB在冠状病毒感染中的促病毒作用。值得注意的是，在目前仅有的病毒研究系统中，GPNMB对PRRSV和PCV2表现出抗病毒作用，表明其功能具有显著的情境依赖性。这种功能差异提示病原体可能差异性地调控GPNMB相关通路，GPNMB可能作为泛病原调节因子发挥作用，其多功能性可能根源于其保守的细胞功能。

研究中观察到PEDV感染上调GPNMB转录但同时降低其蛋白水平这一看似矛盾的现象，提示蛋白水平的下降可能反映宿主旨在对抗PEDV感染的转录后调控反应。在DMV形成方面，鉴于GPNMB在生理条件下与LC3共定位，且冠状病毒可劫持LC3-I用于DMV生物发生，研究人员推测GPNMB可能通过与LC3-I的相互作用促进DMV积累。共聚焦免疫荧光分析显示PEDV感染细胞中GPNMB与LC3的共定位显著增加，GPNMB敲除导致LC3脂化减少，直接支持了GPNMB与LC3之间的功能联系。然而，GPNMB、LC3-I、自噬流与PEDV诱导DMV之间的精确关系仍有待进一步阐明。

关于结构蛋白转运，GPNMB对S蛋白的影响比对N蛋白更为显著。研究人员认为这可能反映两者与GPNMB的相互作用强度或稳定性存在差异，或源于N蛋白自身ER滞留或折叠动力学的不同。与已鉴定的COPII囊泡组分SEC24C和Rab GTPase RAB1B等转运调控因子相比，GPNMB展现出更广泛的作用，不仅影响多种病毒结构蛋白的转运，还影响其表达水平。鉴于快速病毒蛋白合成常导致ER过载和未折叠蛋白积累，GPNMB可能促进病毒结构蛋白的正确折叠和/或ER-高尔基体转运，从而促进其成熟和后续病毒体组装。

本研究的主要局限性在于完全依赖体外细胞培养模型，研究结果的生理相关性需要通过体内实验验证。研究人员计划利用GPNMB敲除仔猪模型或GPNMB抑制剂处理仔猪进行攻毒实验，以评估GPNMB在生理条件下对PEDV复制、蛋白转运和自噬流的作用。

**研究结论**：研究人员将GPNMB鉴定为PEDV复制所必需的促病毒宿主因子。该研究揭示GPNMB具有双重功能：一方面支持复制细胞器（DMVs）的积累以促进病毒RNA合成，另一方面增强结构蛋白S和N的产生。这一机制性见解加深了对PEDV致病机制的理解，并为以GPNMB为靶点的抗病毒策略提供了理论依据。