物理与生化因子对基于三维悬浮培养的干细胞来源β细胞内分泌命运的决定作用

《Cells》：Physical and Biochemical Determinants of Endocrine Fate in 3D Suspension Culture Based Stem Cell-Derived β-Cell Differentiation

　　

摘要
高效且可重复地生成功能性干细胞来源β细胞（sBC）仍是基础研究和细胞替代治疗面临的重大挑战，部分原因在于分化过程中内分泌诱导机制尚未完全阐明，以及临床规模放大存在困难。在本研究中，研究人员在可规模化的三维（3D）分化系统中，系统剖析了常用内分泌分化因子对胰腺祖细胞维持、内分泌定向及激素亚群生成的各自贡献。研究证明，起始多能干细胞聚集体尺寸是决定下游sBC生成的关键因素。研究还证实，一种常用的内分泌诱导分子组合能够有效驱动内分泌谱系定向，但所产生的β细胞数量有限。对单个内分泌诱导分子效应的详细分析揭示了各自不同的作用：EGF或KGF可维持NKX6.1⁺祖细胞而不诱导内分泌分化；Notch或BMP抑制可强烈诱导内分泌标志物表达，但同时降低NKX6.1表达，导致主要生成表达胰高血糖素的细胞；视黄酸、甲状腺激素（T3）或TGFβ抑制可维持高水平的NKX6.1，同时促进高效的胰岛素⁺内分泌分化。上述发现表明，NKX6.1蛋白的维持是决定人β细胞生成的关键因素，并揭示内分泌分化因子对谱系进展具有不同的调控作用。

三维悬浮培养体系中干细胞来源β细胞分化的物理与生化决定因素——论文解读

**研究背景与目的**

糖尿病是一种以胰岛素分泌绝对或相对不足为特征的慢性代谢性疾病，胰岛素-producing胰腺β细胞的替代疗法为其提供了潜在的治愈性治疗策略。过去十余年间，人多能干细胞（hPSC）分化技术的进步已使胰腺祖细胞和干细胞来源β细胞（sBC）的可规模化生成成为可能，这些细胞在体外和体内均能重现原代人β细胞的关键分子、超微结构和功能特征，包括葡萄糖反应性胰岛素分泌。然而，尽管取得了上述进展，现有分化方案仍受限于β细胞生成效率不足以及脱靶细胞类型的频繁出现。这些局限反映了当前对人类系统中调控内分泌诱导和命运决定的发育信号认知仍存在关键空白。

大多数当代sBC分化策略能够较为准确地重现胰腺发育所需的早期阶段，从而高效生成PDX1⁺胰腺前肠内胚层及后续共表达PDX1和NKX6.1的双能胰腺祖细胞。然而，后续的内分泌诱导阶段仍是β细胞生成的一个持续性瓶颈，导致仅能部分获得理想的胰岛素产生细胞表型。内分泌分化通常采用多种信号通路调节因子的组合进行触发，包括抑制Notch（γ-分泌酶）、TGFβ和BMP信号通路，同时联合甲状腺激素或视黄酸的激活。这一分子鸡尾酒方案源于利用小鼠模型研究胰腺器官发生所建立的关键通路文献。然而，由于这些因子通常同时施加，人们对它们在人类体系中各自对祖细胞维持、内分泌定向和激素特化的独立作用缺乏详细了解。

此外，sBC的临床转化对可扩展性、可重复性和生产稳健性提出了额外要求。分化方案必须与可放大的悬浮培养系统兼容，能够在多批次间产生一致的细胞组成，并尽量减少对复杂或成分不明确的因子组合的依赖。因此，从机制上理解单个信号通路在人类模型中如何影响内分泌诱导过程中的命运决定，不仅对于提高分化效率至关重要，而且对于实现sBC产品更稳健、可规模化的生产也具有重要意义。

基于上述背景，研究人员利用基于悬浮的3D分化系统，系统解析了聚集体尺寸和内分泌诱导过程中常用的单个信号分子对胰腺祖细胞维持、内分泌定向（NEUROG3表达）和激素表达的各自贡献。通过时间标志物分析、单因子扰动实验以及胰岛素报告基因hPSC细胞系，研究人员直接比较了不同信号驱动内分泌分化同时保留与β细胞命运相关关键祖细胞特征的能力。

**主要研究结果**

**3.1 悬浮培养中的分化效率取决于初始hPSC聚集体尺寸**

为评估三维培养参数对分化效率的影响，研究人员考察了初始hPSC聚集体尺寸对下游胰腺分化结果的作用。通过改变聚集诱导时的接种密度，生成了直径小于150 μm或约200 μm的hPSC聚集体。直接分化实验显示，较小的聚集体在分化第6天发生塌陷，而较大的聚集体则能顺利存活。利用微孔板生成细胞数量递增的聚集体并追踪其形态变化后，研究人员发现胰岛素表达细胞的分化效率对初始聚集体尺寸高度敏感。每聚集体3000个细胞（3K）的聚集体在整个分化过程中表现出最佳的形态学特征——保持光滑边缘和球形结构，并通过内源胰岛素启动子驱动的GFP报告基因（pINS.GFP）检测到更多的靶细胞生成。相比之下，较小（1K）和较大（5K或9K）的聚集体则呈现不规则形状、碎片增多或出现脱靶囊性结构。量化分析确认3K聚集体具有更一致的聚集体生长动力学和更少的聚集体塌陷。流式细胞术（FC）分析显示，第12天时3K聚集体的β细胞标志物C肽表达水平显著高于较小和较大的聚集体。这些发现表明，最佳聚集体尺寸是三维分化系统中有效谱系进展的先决条件。

**3.2 标准内分泌诱导促进内分泌分化但未能实现稳健的β细胞命运定向**

为深入理解直接分化过程中的内分泌诱导阶段，研究人员检测了第9天至第16天与早期内分泌分化诱导（NEUROG3）、内分泌谱系定向（NKX2.2）和β细胞表型（胰岛素）相关的蛋白标志物表达，所采用的内分泌培养基含有TGFβ、BMP和γ-分泌酶（XXi）信号抑制剂以及激活分子T3。这一分子组合是公认的从胰腺祖细胞分化内分泌细胞类型的成熟方案。结果显示，短暂的NEUROG3表达在第11–12天被稳健检测到，而位于NEUROG3下游的内分泌谱系标志物NKX2.2持续增加，在第16天达到约80%的细胞阳性率，表明该分子组合能有效驱动大多数胰腺祖细胞向内分泌表型分化。然而，第16天时仅约20%的细胞表达胰岛素，提示靶向β细胞命运的定向效率有限。

为进一步探究不表达胰岛素但已完成内分泌定向的细胞是否能够被诱导激活sBC表型，研究人员利用pINS.GFP报告基因在第23天分选pINS.GFP阴性和阳性细胞，以3,000细胞/聚集体重新聚集后在内分泌分子组合中继续培养6天。结果显示，GFP阳性聚集体基本维持了胰岛素报告基因表达，而所有分选的GFP阴性聚集体均未检测到显著的GFP表达。这一结果表明，已定向内分泌但胰岛素阴性的细胞在重新暴露于内分泌诱导培养基后，无法有效生成sBC。

**3.3 内分泌分化常用分子对胰腺祖细胞维持、内分泌分化和激素表达产生不同的效应**

为阐明内分泌分化中单个分子的细胞效应，研究人员将hESC Mel1INS-GFP聚集体分化为以PDX1和NKX6.1为标志的胰腺祖细胞（PP），随后在基础培养基中分别加入单个内分泌分化因子进行培养。活细胞成像显示，使用ALK5抑制剂RepSox进行TGFβ抑制可诱导最高水平的pINS.GFP表达，其次为甲状腺激素T3和XXi。BMP抑制小分子LDN-193189（LDN）和视黄酸（RA）信号激动剂TTNPB可适度诱导pINS.GFP表达，而单独基础培养基或添加EGF、KGF的条件仅显示极低水平。qPCR分析显示，除LDN和XXi导致NKX6.1基因表达显著降低外，大多数因子对PDX1或NKX6.1的表达水平无显著影响。SOX9在所有单因子条件下均较基础培养基对照略有降低。

流式细胞术分析进一步量化了各条件下PP标志物、内分泌标志物及激素的表达。结果显示，EGF、KGF、T3和TTNPB可维持高水平的PP双阳性表达；ALK5i孵育条件下PP细胞百分比同样较高，但NKX6.1高表达群体有所减少；XXi和LDN则显著降低NKX6.1蛋白表达而维持PDX1表达。在内分泌标志物方面，XXi诱导NKX2.2和NEUROD1的效率最高，依次为LDN、TTNPB、ALK5i和T3，而EGF和KGF对内分泌诱导的影响极小。值得注意的是，ALK5i和T3在第16天诱导出最高水平的胰岛素表达，而其他分子仅产生适度的激素表达。这些数据表明，XXi和LDN能强效诱导内分泌分化，但以牺牲胰腺祖细胞标志物NKX6.1为代价；而ALK5i和T3则保留了NKX6.1表达，同时最高效地促进了胰岛素⁺ sBC的生成。

基于上述实验，研究人员提出目前分化方案中使用的因子对人胰腺细胞类型具有不同的调控作用：EGF和KGF可维持高水平的PP及NKX6.1蛋白表达同时阻止内分泌分化；XXi和BMP抑制剂降低NKX6.1表达但强效诱导内分泌分化，主要产生胰高血糖素表达细胞；RA、T3和ALK5i在维持强NKX6.1表达的同时逐渐诱导内分泌分化，并生成可观的胰岛素⁺ sBC。

**讨论与结论**

在讨论部分，研究人员指出，高效生成sBC需要内分泌定向与β细胞命运特化之间的精确协调，而这两者在人类系统中尚未被充分理解。标准诱导条件下可观察到短暂的内分泌转录因子NEUROG3激活及下游标志物的强烈表达，表明内分泌定向是高效的；但尽管如此，仅部分细胞获得β细胞表型，且晚期已定向内分泌但胰岛素阴性的细胞在重新暴露于内分泌诱导信号后无法转化为sBC。这表明在所用培养条件下，内分泌定向与β细胞特化是受时间调控的协调过程，β细胞命运能力被限制在一个特定的发育时间窗口内。

单因子分析为这一解偶联现象提供了机制性见解。Notch通路抑制（XXi）和BMP抑制能有效触发内分泌定向，但同时导致NKX6.1显著下调，使细胞命运偏离β细胞身份，这与小鼠β细胞发育中NKX6.1关键作用的大量体内证据一致。相比之下，TGFβ信号和甲状腺激素信号的调节保留了NKX6.1表达，虽然诱导内分泌分化的程度有限，却产生了最高水平的胰岛素表达。综合来看，数据表明在内分泌诱导过程中维持NKX6.1蛋白表达是三维分化中人β细胞生成的关键决定因素。

在物理因素方面，初始聚集体尺寸对三维培养中的β细胞产量具有显著影响，约200 μm的聚集体表现出最佳的形态学、均一性和胰岛素阳性细胞频率。这一尺寸可能代表了由竞争性物理和生物学约束所决定的功能最优点：低于该阈值时，细胞间接触不足和旁分泌信号有限，可能无法达到维持协调内分泌特化所需的临界质量；高于该阈值时，无血管三维组织中氧和营养物质的扩散限制（约>240 μm）有产生缺氧或坏死核心的风险，同时陡峭的形态发生素梯度可能导致内部祖细胞的错误特化。这些约束共同汇聚于一个能够在周边细胞间通讯与整个核心微环境均一性之间取得平衡的聚集体尺寸。

这些发现对可扩展性和临床转化具有直接意义。内分泌诱导信号在时间、浓度或暴露时长上的微小变化可导致细胞命运的显著偏移，在放大过程中加剧异质性并损害产品一致性。此外，富集或纯化策略在临床规模下难以实施，这更强调了开发从本质上将细胞命运偏向β细胞身份的分化方法的重要性。研究人员也承认，单因子实验主要聚焦于胰岛素和胰高血糖素表达，对其他内分泌激素的更全面分析将有助于进一步阐明谱系分配的机制。为优化β细胞结局而缩短内分泌分化时长的尝试（包括添加ROCK抑制剂）未能在β细胞结局方面产生显著改善，这凸显了发育时序和命运能力在内分泌分化过程中所固有的约束。

研究结论指出，通过合理调节内分泌诱导条件以维持NKX6.1表达，同时控制3D hPSC聚集体结构，为更一致且可规模化的β细胞产品生成提供了路径。通过确定NKX6.1维持和聚集体尺寸为β细胞身份的重要决定因素，该工作为优化内分泌诱导策略提供了机制框架，有助于提高干细胞来源β细胞分化在研究及转化应用中的稳健性。该研究论文发表在《Cells》期刊上。