《Cells》：NLRP3 Marks an Inflammatory Neutrophil–NETosis–Pyroptosis Network in Human Ischemic Stroke Thrombi
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背景：人类缺血性脑卒中血栓日益被认为是在生物学上具有活性的免疫血栓结构。尽管NLRP3炎症小体在实验性卒中病理中起作用，但其在人类脑血栓中的作用仍知之甚少。方法：研究人员分析了通过机械取栓术从34例大血管闭塞所致急性缺血性脑卒中患者体内获取的血栓，采用免疫荧光
背景：人类缺血性脑卒中血栓日益被认为是在生物学上具有活性的免疫血栓结构。尽管NLRP3炎症小体在实验性卒中病理中起作用，但其在人类脑血栓中的作用仍知之甚少。方法：研究人员分析了通过机械取栓术从34例大血管闭塞所致急性缺血性脑卒中患者体内获取的血栓，采用免疫荧光法检测NLRP3、ASC、中性粒细胞（CD66B）、NETosis（H3CIT）、HMGB1和消皮素D（GSDMD）。结果：在所有血栓中均检测到NLRP3，且其与中性粒细胞丰度、NETosis、HMGB1和GSDMD相关，这种相关性独立于纤维蛋白含量。大多数CD66B阳性中性粒细胞表现出ASC免疫反应性。NLRP3及炎症性血栓特征均与卒中严重程度、梗死范围或功能结局无关。结论：人类缺血性脑卒中血栓含有与NLRP3相关的中性粒细胞炎症网络，组织学证据与其炎症小体组装相一致。该特征似乎反映局部血栓生物学而非临床疾病严重程度。
**论文解读：人类缺血性脑卒中血栓中的NLRP3相关炎症网络**
**一、研究背景与科学问题**
急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke, AIS）由大血管闭塞引起，是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一。尽管静脉溶栓和血管内机械取栓等再灌注治疗已取得重大进展，许多患者即使在成功再通后仍出现梗死进展和不良功能结局，提示存在持续的继发性脑损伤机制。越来越多的证据表明，炎症过程贯穿AIS的所有阶段，并显著影响治疗反应和临床结局。传统上，脑血栓栓塞被视为单纯的机械性血管阻塞，但近期组织病理学分析显示，卒中血栓是具有高度异质性的生物学结构，由富含红细胞区域和富含纤维蛋白/血小板区域组成，且含有大量白细胞、炎症介质和细胞外DNA网络。中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）已被证实是血栓组织形成、溶栓抵抗和机械取栓失败的重要促进因素。这些发现促使了“免疫血栓形成（immunothrombosis）”概念的产生，即炎症与凝血途径协同促进血栓形成与稳定化。
NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎症小体是无菌性炎症的核心调节因子。激活后，NLRP3促进caspase-1活化、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）成熟，以及消皮素D（Gasdermin D, GSDMD）的切割，最终导致细胞焦亡（pyroptosis）并释放高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1, HMGB1）等损伤相关分子模式。实验研究表明NLRP3是缺血性脑损伤的重要贡献者，而药理学抑制NLRP3可在多种临床前卒中模型中减轻梗死进展。此外，近期转化研究证据提示，NLRP3依赖性炎症反应在再通前的大血管闭塞期间已被激活。然而，人类脑血栓本身是否存在NLRP3信号及其与已知免疫血栓形成机制的关系尚不清楚。基于此，研究人员假设人类卒中血栓中存在以NLRP3为中心的炎症网络，其特征为中性粒细胞驱动和焦亡相关通路的协同激活，并通过分析机械取栓获取的血栓样本来验证这一假设。
**二、研究设计与主要结论**
该研究纳入2020年至2021年间34例因大血管闭塞导致AIS并在德国维尔茨堡大学医学院接受机械取栓治疗的患者，获取其血栓样本。研究经当地伦理委员会批准，所有参与者均签署书面知情同意书。纳入标准包括基线美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分≥6分、影像学确认的远端颈内动脉（ICA-T）、大脑中动脉M1段或近端M2段大血管闭塞。研究人员通过免疫荧光染色对血栓中的NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、中性粒细胞标志物CD66B、NETosis标志物瓜氨酸化组蛋白H3（H3CIT）、HMGB1和GSDMD进行定性与定量分析，并结合临床数据进行关联分析。
研究发现，所有分析的血栓中均可检测到NLRP3免疫荧光信号，且呈显著的异质性分布，优先富集于富含纤维蛋白、细胞密度高且富含炎症细胞的区域。NLRP3免疫反应性与纤维蛋白面积呈正相关，与红细胞富集区域呈负相关，并与血栓细胞构成度（DAPI染色评估）及中性粒细胞丰度（CD66B染色评估）呈正相关。进一步的相关性分析显示，NLRP3与NETosis（H3CIT）、HMGB1和GSDMD表达均显著正相关；CD66B丰度与NETosis、HMGB1和GSDMD也显著相关；HMGB1与NETosis和GSDMD相关，NETosis与GSDMD相关。通过多变量线性回归分析校正纤维蛋白含量后，NLRP3与CD66B、NETosis、HMGB1和GSDMD的关联仍然独立存在，表明该炎症特征不能仅用血栓在纤维蛋白富集区域的优先分布来解释。在ASC分析中，平均67.7%的CD66B阳性中性粒细胞表现出ASC免疫反应性，且免疫荧光观察到的ASC阳性斑点位于CD66B阳性中性粒细胞内，为炎症小体在中性粒细胞区室中的组装提供了组织学证据。值得注意的是，ASC阳性中性粒细胞的比例与整体中性粒细胞丰度、纤维蛋白面积或红细胞富集区域无关，表明这是血栓相关中性粒细胞的一个一致特征。在临床关联方面，血栓NLRP3免疫反应性与基线卒中严重程度（NIHSS评分）、梗死范围（ASPECTS评分）或随访功能结局（改良Rankin量表mRS评分）均无显著相关性。
该研究的核心结论为：人类缺血性脑卒中血栓含有与中性粒细胞、NETosis、HMGB1和GSDMD相关的NLRP3炎症网络，ASC阳性斑点的额外检测为血栓相关中性粒细胞内炎症小体组装提供了补充性组织学证据，支持局部免疫血栓形成性炎症信号的概念，而非临床卒中严重程度的标志物。该研究发表在《Cells》期刊。
**三、关键技术与方法**
该研究采用的主要技术方法包括：(1) 免疫荧光染色技术，使用针对NLRP3、ASC、CD66B、H3CIT、HMGB1和GSDMD的特异性抗体对冷冻血栓切片进行单标记和双重标记染色，其中双标染色用于定量分析，三重染色仅用于定性可视化；(2) 同种属抗体顺序多重染色技术，通过Fab片段封闭和正常兔血清饱和实现同种属一抗的顺序标记；(3) 基于ImageJ软件的定量图像分析，计算平均荧光强度和阳性面积百分比，并对全血栓区域进行兴趣区勾画和背景扣除；(4) 苏木精-伊红（H&E）染色用于区分纤维蛋白富集区域和红细胞富集区域；(5) 临床资料收集与统计学分析，包括Pearson相关性分析、多变量线性回归分析和相关性网络可视化。
**四、研究结果**
**4.1 NLRP3存在于人类缺血性卒中血栓中并呈现显著空间异质性**
所有34例血栓均检测到NLRP3免疫荧光信号，不同血栓间及同一血栓内部均表现出显著异质性。NLRP3优先在纤维蛋白丰富、细胞密集的炎症细胞富集区域积累（r=0.62，p<0.0001），与红细胞富集区域呈负相关（r=?0.63，p<0.0001），并与DAPI染色评估的细胞构成度（r=0.61，p=0.0002）和CD66B染色评估的中性粒细胞丰度（r=0.61，p=0.002）呈正相关。
**4.2 NLRP3嵌入于协调的炎症性血栓网络中**
NLRP3免疫反应性与NETosis（H3CIT；r=0.60，p=0.0002）、HMGB1表达（r=0.47，p=0.006）及GSDMD表达（r=0.64，p=0.0001）均显著相关。CD66B丰度与NETosis（r=0.47，p=0.005）、HMGB1（r=0.43，p=0.01）和GSDMD（r=0.48，p=0.0074）显著相关。HMGB1与NETosis（r=0.50，p=0.003）和GSDMD（r=0.66，p=0.0001）相关，NETosis与GSDMD也显著相关（r=0.44，p=0.01）。相关性矩阵和网络分析直观地总结了NLRP3、CD66B、HMGB1、H3CIT和GSDMD之间的显著相关关系。
**4.3 血栓相关中性粒细胞中的ASC表达**
ASC免疫荧光定量分析显示，所有分析的血栓中，平均67.7%的CD66B阳性中性粒细胞呈现ASC免疫反应性。免疫荧光图像证实CD66B阳性中性粒细胞内存在ASC阳性斑点。ASC阳性中性粒细胞比例与整体CD66B免疫反应性（r=0.188，p=0.287）、纤维蛋白面积（r=0.005，p=0.977）或红细胞富集区域（r=?0.005，p=0.977）均无相关性，表明炎症小体相关的ASC阳性是不同结构构成血栓中血栓相关中性粒细胞的一致特征。
**4.4 NLRP3与炎症信号的相关性独立于纤维蛋白含量**
包含NLRP3免疫反应性和纤维蛋白含量的多变量线性回归分析显示，NLRP3与NETosis、HMGB1、GSDMD和CD66B的关联均具有独立性。纤维蛋白含量并非NETosis、HMGB1或CD66B的独立相关因素，但与GSDMD信号强度显著相关。
**4.5 血栓相关NLRP3表达与临床参数无关**
血栓NLRP3免疫反应性与基线卒中严重程度（NIHSS）、梗死范围（ASPECTS）或随访功能结局（mRS）之间均无显著关联。
**五、结论总结与讨论**
血栓相关NLRP3与中性粒细胞、NETosis、HMGB1和GSDMD之间的密切关联证实了炎症小体组装、中性粒细胞介导的炎症、DAMP释放和焦亡相关信号通路之间的已知联系。在CD66B阳性中性粒细胞中频繁检测到ASC阳性斑点，为中性粒细胞区室中的炎症小体组装提供了组织学证据。该研究局限性包括：免疫荧光方法仅提供空间信息而非直接的功能读数；研究聚焦于中性粒细胞区室，单核细胞和单核/巨噬细胞谱系细胞未系统研究；样本量限制了更广泛地校正临床和操作变量。综合而言，NLRP3相关性炎症信号体现了血栓的局部免疫血栓形成生物学特征。
