《Cells》：AMPK γ-Subunit Isoform Switching Governs Temozolomide Resistance and Survival in Glioblastoma
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RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）是一大类通过形成生物凝聚体以促进其功能的蛋白质。慢性应激，例如神经退行性疾病中发生的应激，会刺激特定RBP凝聚体作为翻译应激反应的一部分持续积累，这些凝聚体被称为应激颗粒（stress gr
RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）是一大类通过形成生物凝聚体以促进其功能的蛋白质。慢性应激，例如神经退行性疾病中发生的应激，会刺激特定RBP凝聚体作为翻译应激反应的一部分持续积累，这些凝聚体被称为应激颗粒（stress granules, SGs）。这些持续的SGs作为RBP聚集形成神经退行性疾病病理特征的病灶，例如肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）中出现的TAR DNA结合蛋白43（Tar DNA Binding Protein, TDP-43）聚集体。许多在SGs中积累的RBP也与神经退行性疾病相关的突变有关。微管相关蛋白tau是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中主要的细胞内病理标志物。Tau在应激状态下被磷酸化，进而发挥调节SG生物学功能的作用；反之，SGs则充当有毒性的tau寡聚体积累的熔炉。Tau对应激的调节是正常生物学过程的一部分，通常发生在发育和冬眠期间；然而，随着年龄增长，这一过程变得具有病理性，这可能是由于与衰老相关的蛋白质稳态能力下降所致。
1. 引言
在拥有先进医疗技术的国家，个体寿命常远超65岁的老年分界线。然而，进入老年阶段增加了罹患神经退行性疾病的风险，如阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）、血管性痴呆、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脊髓小脑性共济失调（SCAs）等。多种基因突变与这些疾病相关，主要涉及蛋白质稳态、炎症和RNA代谢三大类。大多数疾病由其独特的标志性蛋白质聚集物定义，且这些蛋白质的直接突变足以致病。许多标志性蛋白聚集体参与RNA代谢，包括生物分子凝聚体的生物学过程。研究人员假设，应激状态下生物分子凝聚体的持续性可导致蛋白质聚集。本综述旨在阐述tau病理生理学如何源于作为RNA代谢一部分的正常生物学过程：应激导致tau过度磷酸化和寡聚化，从而调节应激颗粒（一种生物分子凝聚体）和翻译应激反应。由RNA结合蛋白（RBP）或tau产生的蛋白质聚集体破坏多种功能，导致慢性应激状态，广泛影响细胞生物学，干扰自噬溶酶体途径、线粒体途径、脂质稳态失衡和炎症。同时，机体调整蛋白质合成以适应减少的能量和营养供应。所有这些变化都发生在衰老加剧的背景下，影响细胞产生慢性应激反应。因此，对疾病的全面理解需要考虑慢性应激生物学如何促成蛋白质聚集和RNA代谢功能障碍。
2. 神经退行性疾病中病理学的演变
疾病研究者普遍认为蛋白质聚集物的积累驱动神经退行性变。每种神经退行性疾病都与一种或多种标志性蛋白聚集体相关，遗传学研究已确定增强绝大多数此类标志性病理蛋白聚集的突变。对错误折叠或聚集蛋白性质的理解随着领域的发展而深入。冷冻电镜（Cryo-EM）揭示了这些聚集物的结构及其在不同疾病类型间的差异。然而，对病理聚集物的明确界定可能掩盖了实际存在的异质性，且对病理聚集物的关注分散了对更小、更具毒性的寡聚体的研究。导致蛋白质错误折叠和聚集的机制涵盖形成细胞内无定形聚集物和结构明确的淀粉样蛋白聚集物的蛋白质。在应激状态下，tau发生错误折叠并形成结构多样的寡聚体，这些寡聚体比纤维状tau对神经元毒性更大，且其负荷与疾病进展速度相关性更好。聚集物通过三种一般机制造成损害：隔离必需蛋白质（如TDP-43）；通过毒性功能获得机制干扰现有蛋白质的正常功能；以及穿刺膜性细胞器膜。神经退行性疾病的广泛遗传学反映了调节蛋白聚集体积累的蛋白质稳态因素以及机体对聚集物和细胞损伤的炎症反应。
3. 生物凝聚体与液-液相分离
与神经退行性疾病相关的基因中很大一部分属于RNA结合蛋白（RBP），MAPT也属此类。RBP依赖液-液相分离（LLPS）形成生物凝聚体（即无膜细胞器）来介导其生理作用。RBP含有低复杂度结构域（LCDs），通过氢键和Pi键相互作用。带负电的RNA链促进含这些RBP的液滴形成，协调RNA代谢。这种对相分离的依赖在衰老和慢性应激下成为问题。许多疾病相关RBP易转化为不溶性聚集体，部分RBP构象改变形成β-折叠片层。在健康细胞中，错误折叠蛋白和寡聚体被分子伴侣识别、泛素化并清除。然而，衰老或慢性应激损害溶酶体功能，降低清除能力，导致寡聚体和不可溶聚集体积累，推动神经退行性变循环：蛋白质稳态/分解代谢降低→寡聚体和聚集物水平升高→干扰细胞功能引起应激→应激触发翻译应激反应，伴随核RBP向胞质转位→胞质RBP形成SGs→持续的SGs使RBP高浓度聚集，增加其错误折叠、寡聚化和聚集。
4. 翻译应激反应（TSR）
细胞通过减少蛋白质合成以节省能量应对应激。真核起始因子2（eIF2）通路是减少蛋白质合成的经典机制。eIF2α的磷酸化阻止其与翻译复合物结合，终止蛋白质合成。四种激酶控制eIF2α的磷酸化：PERK、PKR、GCN2和HRI，分别响应内质网应激、病毒、营养剥夺和氧化应激。化合物ISRIB能稳定eIF2B二聚体，使其持续激活，绕过eIF2α磷酸化，抑制翻译应激反应（TSR）并驱散SGs。ISRIB在多种神经退行性疾病模型中具有保护作用，能增加突触标记物，但不减少病理标志物，表明其保护作用通过刺激突触功能实现。ISRIB类似物已进入临床试验，但在ALS的II期试验中失败。mTOR是调节蛋白质合成的另一个中枢，通过磷酸化S6激酶调节核糖体功能和蛋白质合成，并通过磷酸化ULK1、ATG13和AMBRA1调节自噬通量。抑制mTOR减少蛋白质合成并增加自噬通量，但雷帕霉素类似物在AD临床试验中尚未显示出前景，因为老年AD患者溶酶体功能受损，自噬体积累。
5. 平行翻译起始通路调节慢性应激反应
真核起始因子4（eIF4）和真核起始因子3（eIF3）通路也参与疾病。eIF3复合体与eIF2α并行调节TSR，但受到的关注较少。eIF2α磷酸化效应是短暂的，一小时后开始恢复。与此同时，整合应激反应的其他部分仍保持活跃，其中一条补偿通路是eIF3d的磷酸化，它在应激至少一小时后才积累，允许关键整合应激反应蛋白（如mTOR、PI3K、FOXO1）的合成。eIF3复合体通过结合mRNA 5‘端启动子区域的N6-甲基腺苷（m6A）修饰来识别RNA靶标，从非经典起始位点刺激蛋白质合成。应激反应的类型和持续时间决定了TSR的调节方式，例如eIF3d选择性响应葡萄糖剥夺而非血清剥夺，且呈延迟性。同样，TDP-43和FUS在不同应激条件下向胞质的转位也不同，由此产生的SGs组成各异。
6. 应激颗粒与神经退行性疾病
RBP是调节TSR的标志性蛋白。应激诱导RBP的翻译后修饰，导致胞质RBP（如G3BP1/G3BP2）通过LLPS开始形成无膜细胞器（MOs），核RBP（如TIA1）也退出细胞核参与成核。LLPS由RBP的LCDs通过简单的化学相互作用介导。RNA通过与RBP结合提高局部浓度并提供离子环境促进此过程，支架蛋白（如CAPRIN1、SERBP1）也通过连接相邻RBP发挥作用。SGs的形成总体上降低蛋白质合成和能量消耗，促进细胞韧性。SGs的功能还包括：eIF3复合体结合带有m6A标记的翻译启动子，刺激应激相关蛋白的合成；SGs可作为对接中心，与溶酶体（通过Annexin A11）和线粒体对接，可能用于运输或提供临时修补。SGs等MOs的状态随细胞条件和相分离持续时间而变化。高流动性的MOs无法传递信号，而玻璃化（流动性降低）的MOs可传递结构变化，固体化则阻断信号传递。许多细胞内的MOs处于凝胶状的玻璃化状态，便于信息传递，这在作为大型相分离细胞器的突触中尤为相关。
7. RBP中的疾病相关突变增加聚集并与疾病相关
多个在MOs中发现的RBP存在与ALS和FTD-TDP43相关的突变，这些突变倾向于发生在驱动LLPS的LCDs中。疾病相关突变不仅增加TDP-43形成SGs的趋势，更显著地影响应激解除后含TDP-43的SGs的解离。TDP-43在形成病理过程中似乎先定位于SGs，随后转变为与功能性SGs分离的病理性包涵体。其他与ALS或FTD相关的RBP突变，如TIA1，也作用于SG通路。TIA1是核心SG成核蛋白，其疾病相关突变增加蛋白聚集倾向，导致SGs解离能力下降，更易促进蛋白质聚集。尽管TIA1突变病例显示TDP-43病理，这可能是因为原发性TIA1聚集引发了有利于TDP-43 MOs/SGs的信号通路。FUS、TAF-15和EWS的突变也倾向于增加其聚集倾向和含这些蛋白的MOs/聚集物积累。对于大多数形成聚集的RBP，其病理生理机制尚不清楚。TDP-43是个例外，其关键病理要素在于向SG发展的过程中，但独立于SG形成。应激导致TDP-43向胞质转位，降低核内水平，从而允许有害的隐性剪接发生，例如STMN2和UNC13a转录本的隐性剪接，其缺失足以导致神经退行性变。
8. Tau与应激颗粒生物学
Tau蛋白在神经元中丰富，并调节SG形成。更多tau导致更大的SGs，而tau缺失使神经元对应激诱导的SG形成产生抵抗。Tau的磷酸化状态决定SG大小。体外研究表明Tau在RNA存在下经历LLPS，并能迅速分配到含RBP TIA1的LLPS液滴中。起初Tau在液滴中可混溶，但随时间推移，Tau开始收缩并排除TIA1，形成凝胶状、玻璃化的相分离物种。Tau与RBP的相互作用具有特异性。重要的是，TIA1的存在刺激了tau寡聚体的形成以及AD及相关痴呆脑中观察到的错误折叠tau类型的产生，这些tau寡聚体对神经元毒性大于纤维状tau。因此，Tau与细胞和体内的SGs以及体外的LLPS RBP液滴相互作用，这些生物分子凝聚体充当有毒tau寡聚体积累的熔炉。研究人员假设Tau具有额外功能。应激激酶导致的Tau过度磷酸化在tau蛋白病的病理生理学中至关重要，但也发生在所有婴儿和冬眠动物中，可能服务于生物学功能。磷酸化刺激Tau快速二聚化/寡聚化，形成的磷酸化寡聚体tau（p-oTau）能增强SGs的形成。这些数据支持Tau在应激期间促进TSR的假说。体内证据也支持Tau在调节翻译中的作用，Tau与核糖体蛋白（如RPS6）和小核仁RNA（SNOs）相互作用，敲除Tau会抑制化学或行为诱导的应激反应。
9. SGs在tau蛋白病病理生理学中的作用
衰老伴随着蛋白酶体系统退化、线粒体效率降低、DNA损伤增加和炎症系统反应性增强，这些都会增强应激反应，导致蛋白质聚集体增多、应激加剧和蛋白质稳态受损，最终促使tau病理从寡聚体tau向纤维状tau转化。在人类AD脑和AD动物模型研究中，病理性Tau在缠结形成的早中期与RBP共定位，且与RNA共定位，符合活性SGs的特征。SGs有两个一般功能：将mRNA与活跃核糖体隔离以减少管家蛋白合成；作为特定应激反应蛋白的合成场所，后者依赖于eIF3识别非经典起始位点。p-oTau与核糖体蛋白（如RPS6）的关联表明其在SGs中执行多种功能。oTau向纤维状tau的转化导致其与许多蛋白（包括RBP）的结合减少，而与终末期病理相关蛋白（如Ubiquitin、SQSTM1、VCP）的结合增加。这种转化有效减少了神经元中游离oTau的量，形成神经原纤维缠结，这些结构似乎比oTau毒性更低。
10. 结论
理解神经退行性疾病的核心问题是为何蛋白质聚集体会在此类疾病中积累。在没有疾病相关突变的情况下，它们仅在衰老效应（如蛋白质稳态下降和炎症增加）显现时才积累。只有少数具有易于聚集的生物物理特性的蛋白质通常会形成与疾病相关的病理性淀粉样蛋白。RNA代谢和RBP的内在生物学是导致疾病相关蛋白质聚集的主要途径之一。RBP通过LLPS形成调节RNA代谢的MOs，其中SGs在应激下形成。持续的SGs在高浓度下汇聚RBP和RNA，为形成致病的淀粉样蛋白提供了条件。衰老或疾病导致的蛋白质稳态受损降低了从MOs中移除错误折叠聚集蛋白的能力。随着淀粉样蛋白积累，它们开始自我模板化并传播进一步的淀粉样蛋白形成，从而导致疾病。该模型为设计疾病相关疗法提供了有力平台，例如化合物ISRIB及其类似物已被推进至临床试验。尽管在ALS中失败，但LLPS/MO/SG通路中的其他元素正在工业界被探索，可能为神经退行性疾病带来进一步的治疗创新。
