发酵牦牛奶来源的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）CD12-1对DSS诱导小鼠结肠炎的预防作用

《Foods》：Preventive Effects of Fermented Yak Milk-Derived Lacticaseibacillus paracasei CD12-1 Against DSS-Induced Colitis in Mice

　　

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病，其特征为黏膜屏障破坏、免疫应答失调及肠道微生物失衡。然而，现有疗法的局限性凸显了安全益生菌干预的必要性。本研究评估了发酵牦牛奶来源的副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）CD12-1对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的预防效果。结果表明，DSS导致小鼠体重下降、疾病活动指数升高、结肠缩短及严重组织病理学损伤。CD12-1以剂量差异性效应缓解了上述异常改变。低剂量处理在组织病理学损伤、杯状细胞丰度、紧密连接完整性、炎症细胞因子及短链脂肪酸方面产生了最全面的改善，而高剂量则更有效地减轻了体重下降。CD12-1增加了结肠ZO-1和Occludin的表达，降低了IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，并提高了IL-10。低剂量还升高了乙酸盐和丁酸盐水平。肠道菌群分析显示，CD12-1与乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、异杆菌属（Allobaculum）、阿克曼菌属（Akkermansia）及若干炎症相关菌群的相对丰度变化相关。相关性分析将乳杆菌属和异杆菌属与较轻的疾病状态及改善的屏障相关指标相关联，而拟杆菌属（Bacteroides）和萨特氏菌属（Sutterella）则与更严重的疾病及炎症相关。总体而言，CD12-1通过改善肠道屏障完整性和炎症稳态，并伴随微生物组成及短链脂肪酸产生的变化，缓解了DSS诱导的结肠炎。

发酵牦牛奶来源的副干酪乳杆菌CD12-1对DSS诱导小鼠结肠炎的预防作用：研究背景、方法、结果与意义解读

一、研究背景与目的

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种慢性、复发性炎症性肠病，主要累及结肠和直肠黏膜。其发生发展涉及宿主遗传易感性、肠道菌群失衡（dysbiosis）、黏膜屏障破坏以及免疫稳态失调等多重因素的交织作用。尽管现有药物如氨基水杨酸制剂、糖皮质激素和免疫抑制剂等能够在一定程度上诱导并维持疾病缓解，但部分患者面临疗效有限、长期用药相关不良反应以及停药后疾病复发等突出问题。更重要的是，受损的肠道微生态和黏膜屏障功能往往难以被现有治疗完全修复。因此，开发安全、有效且适合长期辅助干预的微生态靶向策略，对于UC的预防和管理具有重要意义。

益生菌因其调节肠道生态系统、改善宿主健康的潜力而受到广泛关注。特定乳酸菌菌株可通过调节肠道菌群组成及代谢活性、维持黏液层与紧密连接（tight junction）完整性、抑制过度炎症反应以及调节黏膜免疫稳态等途径，减轻肠道炎症并保护黏膜屏障。然而，益生菌效应具有高度菌株特异性，体外实验或基因组预测所发现的功能属性并不一定能反映其在复杂宿主环境中的实际功效。因此，候选益生菌菌株的抗炎和屏障保护效应必须在设计良好的动物实验中进一步验证。

研究团队前期从传统发酵牦牛奶中分离出一株具有益生潜力的菌株——副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）CD12-1。该菌株表现出对酸性环境、胆汁盐和模拟胃肠液的良好耐受性，并具有抗氧化活性和良好的安全性记录。全基因组分析进一步揭示了多个可能与环境适应和益生功能相关的候选基因。这些特性提示CD12-1能够在胃肠道转运中存活并在肠道环境中保留功能活性，为评估其对抗肠道炎性损伤的能力提供了生物学依据。然而，CD12-1是否能够预防结肠炎并调节肠道屏障功能和肠道微生物稳态，此前尚无研究报道。基于此，本论文采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的小鼠实验性结肠炎模型，系统评估不同剂量CD12-1的预防效果，从疾病活动度、结肠长度、组织病理学损伤、杯状细胞丰度、紧密连接蛋白表达、炎症细胞因子水平、短链脂肪酸浓度以及肠道菌群变化等多维度切入，探究该菌株缓解结肠炎的潜在途径，为其进一步开发为候选益生菌提供实验基础。该论文发表于《Foods》。

二、研究开展与主要技术方法

为系统验证CD12-1的预防效果，研究人员以60只6周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠为研究对象（购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心），随机分为正常对照组（C）、DSS模型组（D）及低（L）、中（M）、高（H）三个剂量干预组，每组12只。实验共持续3周：前2周各干预组分别灌胃给予2×10⁷、2×10⁸和2×10⁹ CFU/天/只的CD12-1菌悬液，对照组和模型组灌胃等量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）；第3周除正常对照组外，其余各组自由饮用含2.5%（w/v）DSS（分子量36,000–50,000 Da）的水以诱导急性结肠炎。实验结束后，采集结肠组织和盲肠内容物进行后续分析。关键技术方法包括：通过疾病活动指数（DAI）评分和结肠长度测量评估疾病严重程度；通过苏木精-伊红（H&E）染色进行结肠组织病理学评分；通过过碘酸-雪夫（PAS）染色评估杯状细胞数量；通过免疫组织化学（IHC）检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达与分布；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定结肠组织IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平；通过16S rRNA基因V3-V4区高通量测序分析盲肠内容物中肠道菌群组成；通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量检测肠道内容物中短链脂肪酸（SCFAs）浓度。每组取6只小鼠用于全部表型、组织学、生化及菌群分析，以保证各终点指标间的个体匹配。

三、研究结果

3.1 CD12-1改善了UC症状

DSS造模期间，模型组小鼠体重自第3天起显著下降，DAI评分逐步升高并于第7天达峰值，结肠长度较正常对照组显著缩短。与模型组相比，三个剂量干预组均不同程度地改善了上述异常，第7天DAI评分均显著低于模型组，结肠长度也均显著增加；但三个剂量组间结肠长度无显著差异。高剂量组在缓解体重下降方面效果最为突出。

3.2 CD12-1减轻了组织学损伤和杯状细胞耗竭

H&E染色显示，模型组结肠出现严重的黏膜上皮脱落、固有层暴露、细胞坏死、隐窝萎缩消失及大量炎症细胞浸润，组织病理学评分显著升高。CD12-1干预显著降低了组织病理学评分。值得注意的是，低剂量组结肠结构基本保持正常，隐窝充盈清晰且炎症浸润有限，其组织学评分与正常对照组无统计学差异。PAS染色结果表明，模型组杯状细胞数量显著减少且黏液分泌功能受损；CD12-1各剂量干预均显著抑制了杯状细胞丢失，其中低剂量组与正常对照组无显著差异。

3.3 CD12-1改善了肠道上皮屏障功能

免疫组化结果显示，DSS破坏了大肠上皮细胞间ZO-1的连续蜂窝状分布模式，并显著降低了ZO-1、Occludin和Claudin-1的平均光密度（AOD）值。CD12-1干预后，低剂量组ZO-1和Occludin的AOD显著升高，分别达到与正常对照组无显著差异的水平，且Occludin在肠腺内的分布趋于均匀；中、高剂量组上述指标仅有升高趋势，未达到统计学显著。Claudin-1表达虽在干预后呈上升趋势，但各剂量组与模型组间均无显著差异。这一结果表明CD12-1对紧密连接蛋白的调节具有选择性。

3.4 CD12-1减轻了结肠组织炎症细胞因子水平

模型组促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平较正常对照组显著升高，而抗炎因子IL-10水平显著降低。CD12-1干预后，低剂量组的TNF-α和IL-1β水平显著下降并接近正常水平，IL-6也显著降低；中剂量组的TNF-α和IL-1β亦显著降低。尽管高剂量组上述促炎因子均有下降趋势，但未达到统计学显著。IL-10在低、中剂量组有不同程度的恢复，其中低剂量组恢复更明显，但各干预组与模型组和正常对照组均无显著差异。上述发现与组织学改善、杯状细胞恢复和紧密连接蛋白表达提升具有一致性。

3.5 CD12-1调节了DSS破坏的肠道菌群

16S rRNA基因测序分析显示，α多样性方面，低剂量组的Chao1指数显著高于其他各组，而高剂量组的Shannon指数显著较低。β多样性分析显示，正常对照组与所有DSS暴露组在PCoA图上明显分离，模型组与低、中剂量组大体重叠，而高剂量组呈现相对独立的分布。在门水平上，DSS显著降低了Firmicutes和Actinobacteria的相对丰度，显著升高了Bacteroidetes和Proteobacteria的相对丰度；高剂量干预显著逆转了Actinobacteria的下调。在属水平上，DSS显著降低了Allobaculum、Lactobacillus、Bifidobacterium和Ruminococcus的相对丰度，显著升高了Bacteroides和Oscillibacter的相对丰度。高剂量CD12-1显著提高了Allobaculum丰度并显著降低了Oscillibacter丰度。差异丰度分析进一步显示，高剂量组显著富集了Akkermansia、Parabacteroides、Turicibacter、Bifidobacterium和Allobaculum，同时显著消耗了Oscillospira和Desulfovibrio；低剂量组显著富集了Turicibacter和Lactobacillus；中剂量组则富集了Parabacteroides和Prevotella。这些结果表明CD12-1通过增加潜在有益菌群并降低炎症相关菌群的丰度来调节结肠炎小鼠的肠道菌群结构。

3.6 肠道菌群与结肠炎相关指标的相关性

Spearman相关性分析显示，Lactobacillus与DAI、组织学评分和IL-1β呈显著负相关，与杯状细胞数、ZO-1和Occludin呈显著正相关；Allobaculum与结肠长度、杯状细胞数和Claudin-1呈正相关，与DAI、组织学评分和IL-1β呈负相关。与之相对，Bacteroides与DAI、组织学评分、IL-1β和IL-6呈正相关，与结肠长度、杯状细胞数及各紧密连接蛋白呈负相关，表现出最明显的不利关联模式。Paraprevotella和Sutterella也与疾病严重程度指标呈正相关。Bifidobacterium与DAI呈负相关，Desulfovibrio与结肠长度呈负相关。这些相关性提示特定菌属与结肠炎表型间存在关联，但并不直接证明因果关系。

3.7 CD12-1提高了肠道SCFAs浓度

模型组乙酸、丙酸和丁酸浓度均显著低于正常对照组，而异丁酸、戊酸和异戊酸无显著变化。低剂量干预显著提高了乙酸和丁酸浓度，均恢复到与正常对照组相当的水平；中剂量干预显著提高了乙酸浓度；高剂量组的戊酸浓度反而显著低于模型组，其余SCFAs无显著变化。这表明CD12-1对SCFA产生的调节存在剂量依赖性。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出，DSS诱导的结肠炎模型很好地模拟了UC的多种临床和组织病理学特征，是评估益生菌候选株防治效果的标准模型。本研究中CD12-1的抗结肠炎效应并未呈现出单调的剂量-反应关系：高剂量在缓解体重下降方面更有利，而低剂量在组织学、屏障功能、炎症因子和SCFAs等多维度指标上改善最全面。既往研究也报道过类似非线性的益生菌剂量效应，提示更高的益生菌剂量不必然带来更大的宿主获益。研究者推测这种非线性反应的生物学基础尚不清楚，因为本研究未直接定量检测CD12-1在肠道内的定植丰度、存活时间及代谢活性。就机制而言，CD12-1可能主要通过以下途径发挥保护作用：一是通过保护杯状细胞和黏液层、维护紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达来改善肠道黏膜屏障完整性；二是通过抑制促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的产生并促进抗炎因子IL-10的恢复来维持肠道免疫稳态；三是通过重塑菌群结构，增加Lactobacillus、Bifidobacterium、Allobaculum和Akkermansia等有益菌属的丰度并降低Bacteroides、Sutterella和Desulfovibrio等炎症关联菌属的丰度，以及恢复乙酸和丁酸等SCFAs的产生水平来发挥协同效应。但需要强调的是，16S rRNA基因分析不能解析微生物的代谢活性，菌群组成与SCFA浓度的平行变化并不能直接证明因果关系，各菌属与表型间的相关性分析也只能作为支持性关联。此外，本研究存在若干局限性：仅使用了雌性小鼠和急性DSS模型，无法涵盖性别相关差异及人类UC慢性、复发性和多因素的特征；CD12-1在DSS暴露前及暴露期间给药，故数据主要支持预防效应而非对已确立结肠炎的治疗效果；每组仅6个生物学重复的菌群分析可能限制了检测微生物差异的统计功效。

结论部分可总结为：发酵牦牛奶来源的CD12-1通过减轻临床和组织病理学损伤、改善黏液层及紧密连接屏障、调节炎症反应，并伴随SCFA水平和肠道菌群组成的变化，缓解了DSS诱导的小鼠结肠炎。各剂量组的效果存在差异，其中低剂量组表现出最全面的保护作用。这些发现支持CD12-1作为候选益生菌的进一步开发应用，但其关键分子机制和最佳干预剂量仍需后续研究加以验证。