非参数差异甲基化分析表征上皮性卵巢癌组织学亚型特异的启动子区域

《Epigenetics》：Non-parametric differential methylation analysis characterizes histotype-specific promoter regions in epithelial ovarian cancer

　　

摘要
上皮性卵巢癌(EOC)是一种异质性疾病，常于晚期确诊且死亡率高，目前尚无可靠的筛查方法。近年来，以CpG富集区域DNA甲基化形式存在的表观遗传生物标志物因其稳健性和易获取性而受到科学界的日益关注，可在无需侵入性手术的情况下实现诊断。本研究通过非参数方法探讨早期EOC启动子区域的异常甲基化，旨在表征候选表观遗传生物标志物。该方法应用于一组早期EOC样本队列，并将结果与现有的差异甲基化分析程序进行比较。随后利用显著区域构建CpG panel，通过外部数据中的预测性分类对EOC组织学亚型进行分层。所识别的启动子区域在不同队列间具有高度可重复性，所构建的CpG模型通过预测性分类在外部队列中成功实现了组织学亚型分层。与其他DMP和DMR检出程序的比较显示，结果之间存在一定程度的同质性，但也揭示了部分启动子区域虽具有明显的异常甲基化迹象却被忽略。最后，研究发现EOC组织学亚型的甲基化分布类型存在差异，结果表明对非正态分布数据敏感的方法可能不适合用于比较具有不同分布类型的组别。该非参数方法识别出跨队列高度可重复的异常甲基化启动子区域，预测性分类结果表明这些区域可能有助于EOC组织学亚型分层。
关键词：表观遗传学；生物标志物发现；方法优化；预测性分类

论文解读：非参数差异甲基化分析表征上皮性卵巢癌组织学亚型特异的启动子区域

**一、研究背景与问题**
卵巢癌(OC)是一种异质性疾病，约占女性癌症相关死亡总数的20%，其中恶性上皮性卵巢癌(EOC)占OC总病例的90%，可细分为五种主要组织学亚型：高级别浆液性癌(HGSC)、低级别浆液性癌(LGSC)、透明细胞癌(CCC)、子宫内膜样癌(EC)和黏液性癌(MC)。尽管各亚型在形态学、发病率、临床结局和分子特征上存在显著差异，EOC的治疗通常仍采用标准化的减瘤手术联合铂类化疗方案。早期(Ⅰ-Ⅱ期)EOC的预后显著优于晚期(Ⅲ-Ⅳ期)，但该病早期常无症状，现行筛查方法不足，因此亟需更有效的、能反映原发肿瘤生物学特征的生物标志物，以改善早期诊断和组织学亚型分层。

DNA甲基化作为一种化学稳定的过程，存在于体液中的游离细胞DNA(cfDNA)中，基于DNA甲基化的生物标志物无需侵入性手术即可实现肿瘤指纹分析。已知EOC组织学亚型在表观遗传和转录水平上均为独立实体，因此功能重要基因组位点的异常甲基化模式已成为疾病监测和检测候选生物标志物的有前景来源。然而，既往研究虽表明EOC启动子甲基化与患者预后相关且具有诊断价值，但尚无研究针对EOC组织学亚型分层目的系统考察启动子甲基化。

**二、研究内容与结论**
该研究建立了一种基于预定义启动子区域的非参数分析策略：两组间比较采用Brunner–Munzel检验，多组比较采用Kruskal–Wallis检验及随后的Dunn检验衡量显著性，效应量(β)通过Tukey三均值(TM)估算。研究目标为：(1)识别EOC中单一组织学亚型特有的甲基化启动子区域；(2)评估分布类型对EOC DNA甲基化分析中显著性和效应量的影响。研究使用86例早期EOC样本作为训练队列(GSE326000)，覆盖四种主要组织学亚型(HGSC、MC、EC、CCC)，并用七个外部基于芯片的EOC甲基化数据集进行验证。

**三、主要技术方法**
研究人员从公共数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获取训练队列和验证队列的原始.idat文件，使用统一的R(v.4.3.0)生物信息学流程处理数据。预处理包括检测p值过滤、SNP位点剔除、交叉反应探针过滤，以及Noob和BMIQ归一化。启动子区域定义为转录起始位点(TSS)上游2000 bp至下游200 bp。非参数差异甲基化分析采用Kruskal–Wallis检验、Dunn检验、经验布朗方法(EB)聚合p值，Tukey三均值计算效应量。预测分类使用XGBoost算法构建二分类和多分类模型，在外部测试队列中验证。

**四、研究结果**
**CpG覆盖与分布类型**
EPIC阵列中20,033个蛋白编码基因中有18,944个基因的启动子区域至少含有一个CpG位点。训练队列中CpG位点的低甲基化(~30%)、半甲基化(~20%)和高甲基化(~50%)比例在各组织学亚型间相似，但分布类型差异显著。HGSC样本中CpG位点更多呈现重偏态分布，MC样本则具有最高频率的正态分布位点。该模式在外部测试队列中同样可观察到。

**差异启动子甲基化分析与差异甲基化分析**
非参数方法共识别出120个显著差异甲基化的启动子区域(np-promoters)：CCC 35个、HGSC 31个、MC 54个，EC未识别出。与ChAMP和minfi的DMP检出程序比较，np-promoter中91–100%的CpG位点在1/2个比较中被同时判定为显著DMP。与四种DMR检出程序(bumphunter、DMRcate、probelasso、sesame)比较，6.9%–39.7%的np-promoter区域与DMR重叠，表明该方法既能复现已有方法的检出结果，也能表征被其他方法遗漏的区域。

**分布类型对显著性和效应量的影响**
参数检验与学生t检验和Tukey检验比较显示，非参数方法与参数方法在两组比较和多重比较中的p值存在差异，尤其在涉及至少一个非正态分布组的比较中差异最大。均值与三均值的Δβ差异也呈现相同模式，表明分布类型确实影响统计推断结果。

**预测分类**
通过逐步特征选择和网格搜索，最终构建了包含11个基因启动子区域47个CpG位点的多分类模型(CCC: CEBPA、ENSG00000285218、ARL10；HGSC: UPK1B、CD81、PDE4B、S100A5、HNF1B；MC: MX2、ANKRD40CL、ADAM12)。该模型在外部测试队列中的AUC为82.6%–88%，平均PR AUC为70%–79%，CCC和HGSC的敏感性和F1评分为76%–94%，所有组织学亚型的特异性超过95%(除GSE51820中HGSC为81%)。二分类模型性能与多分类模型相当。

**外部验证**
外部队列验证显示，CCC中17/35个np-promoter区域的最大标准差(SD)<0.1，HGSC中22/31个区域满足该标准，MC中8/52个区域达标。将np-promoter方法应用于测试队列时，HGSC的np-promoter在与其他亚型比较时通常能通过显著性阈值，但与EC比较时因高度同质性而未能通过。文献综述发现，CCC中20/35、HGSC中20/31、MC中39/54的np-promoter区域基因与癌症显著相关。

**五、讨论与结论**
讨论部分指出，EOC甲基化β值往往服从偏态或非正态分布，HGSC和MC的分布类型模式跨队列可重复。参数方法(如t检验、算术平均值)可能因数据违反正态性假设而产生假阳性或假阴性结果。非参数方法识别出的np-promoter区域在外部数据中高度可重复，基于其CpG位点构建的分类模型能够有效区分EOC组织学亚型。EC未识别出np-promoter区域的原因可能与其与HGSC或MC的同质性有关，这种二元特性可能源于低级别和高级别EC的差异。研究的局限性包括未考虑启动子区域内甲基化的空间相关性、Δβ>0.2的阈值基于惯例而非统计学依据、外部队列间存在平台和方案差异、样本量小且不平衡等。

研究结论认为，EOC组织学亚型在表观遗传上具有异质性，EOC甲基化数据不满足正态性假设，非参数方法能有效识别单一亚型特有的异常甲基化启动子区域，这些区域在已有DMP/DMR方法中可重复检出，与现有文献中的癌症关联性一致，在外部数据中高度可重复。基于这些区域CpG位点构建的分类模型对所有考察亚型(EC除外)的PR AUC均超过70%。所提出的np-promoter区域有望作为EOC组织学亚型分层的候选生物标志物。