《European Journal of Phycology》：Diversity of green algae associated with littoral amphibious lichens
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摘要：全球海岸带的潮间带波动区域栖息着地衣，然而其绿藻光生物（photobiont）的多样性与特异性仍知之甚少。研究人员利用核糖体小亚基（nrSSU）和核糖体内转录间隔区（nrITS）DNA序列的系统发育分析，对采自瑞典和德国13个沿海位点的两栖地衣Verru
摘要：全球海岸带的潮间带波动区域栖息着地衣，然而其绿藻光生物（photobiont）的多样性与特异性仍知之甚少。研究人员利用核糖体小亚基（nrSSU）和核糖体内转录间隔区（nrITS）DNA序列的系统发育分析，对采自瑞典和德国13个沿海位点的两栖地衣Verrucaria ceuthocarpa和V. ditmarsica的光生物多样性进行了表征。多数光生物隶属于Kornmanniaceae科（石莼目，Ulvales），证实了该科在这些栖息地中的核心作用。除常见报道的藻类Pseudendoclonium commune和P. submarinum外，研究人员还检测到四个此前未知的谱系：两个Pseudendoclonium新种、一个与Kornmannia leptoderma相关的谱系，以及一个科内推定未描述的新属。研究同时确认了绿藻属Urospora（丝藻目，Ulotrichales）作为地衣光生物的存在，这是该属在欧洲的首次记录。该属与此前报道的来自智利的地衣相关菌株聚为一支，提示该属在海滨地衣中具有更广泛的生态重要性。重要的是，研究人员表明，通过碘染色可在地衣叶状体内直接以显微方式清晰区分Urospora，碘染色可显示每个细胞中多达三个蛋白核（pyrenoid）。综上，这些发现拓展了当前对海滨地衣共生所必需藻类的认识，揭示了大量隐藏多样性，并为潮间带绿藻的未来分类学与生态学研究提供了框架。
**研究背景与科学问题**
地衣是真菌与藻类或蓝藻形成的互惠共生体，几乎遍布全球各类陆地生态系统。绝大多数陆生栖境中的地衣光生物属于共球藻纲（Trebouxiophyceae），但在沿海岸带环境中，伴随海水浸没、波浪冲击、盐雾、光照和脱水等环境因子的梯度变化，光生物类群向海方向发生更替，石莼纲（Ulvophyceae）藻类逐渐取代共球藻纲成为优势光生物。具体而言，在中生亚沿海及真沿岸带（lower mesic-supralittoral and eulittoral zones）的地衣中，最常见的共生藻属于Kornmanniaceae科（石莼目）。然而，该生态带中许多地衣物种的光生物身份数据仍然匮乏，近期的研究表明其中尚有大量多样性未被揭示。
海岸带栖息地是全球气候变化威胁最严重的生态系统之一。要预测群落未来的演变，必须建立在对群落结构及其物种生态位形成机制的扎实认知之上。对地衣这类共生生物而言，这一任务尤为艰巨：共生特性是否使其像造礁珊瑚一样对胁迫高度敏感？抑或共生组合的灵活性及共生伙伴的广泛生态幅能够提供适应气候变化的韧性？高质量的生物多样性数据是回答这些根本问题的关键第一步。本研究旨在拓展对潮间带波动区域地衣光生物多样性的认识，通过采样北欧地区研究较少的物种，结合分子标记对真菌和藻类共生伙伴进行鉴定，以期发现新的藻类谱系。
**主要技术方法**
研究人员从瑞典（5个地点）和德国（4个地点）共13个采样位点采集了两栖地衣Verrucaria ceuthocarpa（n=5）、V. ditmarsica（n=18）及一个未鉴定Verrucaria sp.（n=1）。采用CTAB法提取地衣叶状体及培养藻株的DNA；对共生真菌扩增核糖体内转录间隔区（nrITS）和线粒体小亚基核糖体DNA（mtSSU），对光生物扩增核糖体小亚基（nrSSU）和nrITS，并进行Sanger测序；利用最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）构建系统发育树；对三个含Urospora的标本尝试人工海水培养基分离培养；对一个叶状体样本（Balt49）进行ITS2元条形码（metabarcoding）测序以筛查体内光生物群落；使用碘（Lugol's solution）染色观察藻细胞形态特征。
**研究结果**
*地衣共生真菌多样性*
基于mtSSU的Verrucariaceae科整体系统发育分析显示，末端类群多获得充分支持，但主干节点支持率较低。基于nrITS/mtSSU串联数据的系统发育分析表明，形态种V. ditmarsica呈多系性，包含多个隐存种，本文将其标记为谱系D1–D6。其中D1包含研究中最常采集到的基因型；D2因mtSSU与D1一致但其nrITS无法与其余V. ditmarsica序列明确比对而被视为独立分类单元；D3包含GenBank中的V. ditmarsica标本Orange 16340，而D4为新谱系。六个谱系总体差异较大，mtSSU相似性仅约95%（D1与D2除外），nrITS相似性约90%。对Wahlenbergiella类群的分析将V. ceuthocarpa置于一个与V. degelii共同组成且充分支持的谱系中。
*光生物多样性*
从24个地衣叶状体中共获得29个光生物，差异源于两个叶状体直接扩增的nrITS与nrSSU不一致，以及三例培养藻与直接测序结果不同的情况。共发现7个地衣光生物种或种级谱系，其中24个属于Kornmanniaceae科：主要为Pseudendoclonium属的P. commune和P. submarinum，另有新谱系Pseudendoclonium sp. P2和P3。P2在属内的系统发育位置未获解决；P3与P. arthropyreniae相关，其nrITS与巴塔哥尼亚海滨地衣中检出的菌株US5028有98%相似性。此外发现科内两个此前未知的谱系：一个与Kornmannia leptoderma相关的Kornmannia sp.，以及一个在科内位于基部的Kornmanniaceae sp.谱系。
Urospora（丝藻目）光生物发现于瑞典厄勒海峡岸边的V. ceuthocarpa标本中，2019年9月初次采集，2021年11月复采确认该属存在。培养尝试未成功。nrITS系统发育分析将这些光生物与来自智利的Urospora光生物聚为一支，并与未描述种'Viking'共同构成U. wormskioldii的内侧谱系，但支持率不足。
*共生配对与光生物多重性*
菌根谱系V. ditmarsica D2和D3及Verrucaria sp.分别仅与单一光生物谱系相关，分别为Kornmannia sp.、Pseudendoclonium sp. P2和Kornmanniaceae sp.。V. ditmarsica D1的8个样本与P. commune相关，2个样本与P. submarinum相关，另有2个样本同时含有P. submarinum和P. commune。D4谱系的两个标本则各自与不同的Pseudendoclonium种相关。V. ceuthocarpa始终与Urospora相关，其中3个样本还同时含有Pseudendoclonium sp. P3——该藻通过培养获得，而Urospora经叶状体直接测序获得。
*地衣体内光生物多样性*
对样本Balt49进行元条形码分析，两个重复共获得85,509和42,066条有效读数，对应7个藻类物种的11个OTU。67%的读数属于Urospora sp.，24%为Pseudendoclonium sp. P3，6%为P. submarinum，2%为P. commune，其余不足1%分别为Halofilum prostratum、Paulboradya prostrata和Ulva intestinalis。该结果支持Urospora是V. ceuthocarpa的主要光生物，而Pseudendoclonium sp. P3为辅助光生物。
*Urospora的显微观察*
经碘染色后，Urospora细胞中多达三个蛋白核清晰可见，而Kornmanniaceae光生物每个细胞通常仅含一个蛋白核。这一形态特征可在叶状体内直接区分二者。
**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管海岸带的壳状地衣群落在形态学上已被长期记录，分子数据持续揭示出隐藏的（半）隐存多样性。本研究中V. ditmarsica包含多个亲缘关系疏远的谱系，目前尚不清楚其中是否含有真正的V. ditmarsica或V. erichsenii，需要后续分类学研究。Kornmanniaceae科光生物在使地衣适应潮间带栖息地方面发挥核心作用，同时其多样性仍被大幅低估。Verrucariaceae家族的光生物关联范围异常宽泛，涵盖共球藻纲、黄藻纲、褐藻纲及石莼纲等多个类群，这种灵活性可能反映了生态异质性或较近的演化起源。Urospora现为已知的第三个与地衣叶状体相关的丝藻目记录，其在北欧岩石上的微藻群落中常见，可能是被忽视的常见地衣光生物。Urospora光生物的具体种级身份尚待解决，属内核糖体标记变异极低，需开发合适的条形码标记。碘染色法为地衣叶状体内光生物的直接鉴定提供了便捷工具。
结论部分表明，Kornmanniaceae（石莼目）绿藻在使地衣耐受上沿岸带及潮间带极端波动条件中发挥核心作用，而Urospora（丝藻目）是潜在重要的地衣共生伙伴。本研究揭示海滨地衣——无论共生真菌还是光生物——的多样性远未得到充分探索，阐明这些隐藏多样性及维系此类共生关系的生态与生理机制仍需进一步研究。
