严重白蛋白尿对促炎性单核细胞亚群CD14++CD16+及抗原特异性免疫应答的影响

《International Journal of Molecular Sciences》：The Impact of Severe Albuminuria on the Proinflammatory Monocyte Subset CD14++CD16+ and Antigen-Specific Immune Responses

　　

肾功能丧失与免疫系统过早老化相关，然而早期针对该主题的研究纳入的是肾小球滤过率（GFR）降低的患者，并未区分其是否伴有蛋白尿。临床观察提示，单独的蛋白尿也可能损害免疫防御功能。因此，一个悬而未决的问题是：尿白蛋白与肌酐比值（uACR）> 300 mg/g（严重白蛋白尿）的患者，无论其估算肾小球滤过率（eGFR）如何，是否具有炎症风险谱及适应性免疫应答紊乱。这项横断面研究纳入了25例严重白蛋白尿患者（uACR > 300 mg/g；P组）、19例eGFR < 60 mL/min/1.73 m²且uACR < 300 mg/g的患者（G组），以及30例肾功能正常的患者（C组）。三个队列均具有相似的心血管背景，合并动脉高血压和冠状动脉疾病。研究人员将患者的外周血单个核细胞（PBMCs）分别用超抗原葡萄球菌肠毒素B（SEB）以及巨细胞病毒（CMV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）特异性抗原进行刺激。通过流式细胞术测定单核细胞亚群及CD86和HLA-DR的表达。通过定量聚合酶链反应（qPCR）检测CD28及I型干扰素（IFN-α）和II型干扰素（IFN-γ）的转录本。与C组相比，G组患者表现出更高的多克隆SEB反应，并且循环中炎症性单核细胞（CD14⁺⁺CD16⁺亚群）数量显著升高。与C组相比，P组和G组的CD28转录本均降低，其中G组达到显著性差异。通过CD4⁺CD69⁺CD137⁺和CD8⁺CD69⁺CD137⁺ T细胞频率所测定的CMV和SARS-CoV-2特异性免疫应答在三组中具有可比性。严重白蛋白尿本身并不改变抗原特异性免疫应答；然而，GFR降低的患者（而非蛋白尿患者）表现出炎症性和多克隆免疫激活。

**严重白蛋白尿、促炎性单核细胞亚群与抗原特异性免疫应答：基于eGFR与蛋白尿分层的临床研究解读**

**一、研究背景与科学问题**

慢性肾脏病（CKD）影响全球约10%的普通人群，已成为日益严重的公共卫生问题。除高血压、糖尿病和心血管疾病等典型危险因素外，感染是CKD患者面临的主要威胁之一。CKD本身即增加发生严重急性和慢性感染（如COVID-19）的风险，感染也是推动CKD患者发病率和死亡率升高的重要因素，并导致更高的住院率。CKD中的免疫系统损伤可导致病毒性感染（如肝炎、巨细胞病毒和COVID）发生率升高。对感染应答不充分的原因至少部分归因于B7-2（CD86）信号受损、淋巴细胞数量减少以及共刺激分子CD28表达降低，这些缺陷损害了抗原识别和抗原呈递过程。值得注意的是，这些抗原特异性缺陷发生在炎症增强的背景之下。

CKD的分级依赖于估算肾小球滤过率（eGFR）和白蛋白尿（以尿白蛋白与肌酐比值uACR评估）两个指标。以往关于CKD免疫衰老的研究多纳入GFR降低的患者，并未区分其是否合并蛋白尿。然而临床观察提示，单纯蛋白尿也可能损害免疫防御功能。因此，eGFR和白蛋白尿这两个CKD核心指标对免疫系统的影响是否相互独立，尚缺乏直接证据。既往研究表明白蛋白尿与炎症存在关联，这引出了一个关键问题：白蛋白尿是否不仅影响炎症，还影响特异性免疫应答。本研究旨在分离肾功能减退与蛋白尿对细胞免疫标志物的独立影响，并分别与肾功能正常的对照组进行比较。研究人员聚焦于与心血管疾病相关的促炎性单核细胞亚群CD14⁺⁺CD16⁺，并使用葡萄球菌肠毒素B（SEB）作为多克隆刺激物，以SARS-CoV-2和CMV特异性抗原刺激患者PBMCs，从而评估细胞免疫反应性。

**二、研究设计与关键技术方法**

本研究为横断面研究，纳入三组患者：25例严重白蛋白尿患者（uACR > 300 mg/g，P组）、19例eGFR < 60 mL/min/1.73 m²且uACR < 300 mg/g的患者（G组），以及30例肾功能正常患者（C组）。所有患者均来自德国哈勒-维滕贝格大学内科II诊所的门诊和住院部门。排除标准包括年龄<18或>89岁、接受肾脏替代治疗、入组前4周内使用任何免疫抑制治疗、入组前12个月内使用利妥昔单抗/环磷酰胺/奥滨尤妥珠单抗、入组前2周内有感染临床/辅助检查征象、Child–Pugh C级肝硬化、活动性恶性肿瘤、入组前4周内输血及妊娠。

主要技术方法包括：采用Trucount管结合流式细胞术测定全血中绝对细胞计数；通过Ficoll密度梯度离心分离PBMCs；分别使用PepTivator CMV pp65/CMV IE1和PepTivator SARS-CoV-2（Prot_S complete）抗原以及SEB超抗原刺激PBMCs，通过流式细胞术检测CD4⁺CD69⁺CD137⁺和CD8⁺CD69⁺CD137⁺ T细胞频率评估抗原特异性及多克隆T细胞活化；采用TaqMan探针qPCR检测CXCL10、IFN-γ、IFN-α、CD28及内参RPL37A的mRNA表达；使用ELISA检测血清IFN-α和IFN-γ水平及CMV IgG抗体。

**三、研究结果**

**3.1 人口学特征**

P组和G组患者的中位eGFR分别为41.2和25.4 mL/min/1.73 m²，C组肾功能正常（中位86.0 mL/min/1.73 m²）。三组患者均具有较高的全身性动脉高血压患病率，血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂/血管紧张素受体阻滞剂（ARB）药物使用及心血管风险特征（冠状动脉疾病CAD、脑血管疾病CVD）无组间差异。三组的C反应蛋白（CRP）和白细胞介素-6（IL-6）均轻度高于参考水平，提示三组存在相似的炎症背景。钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂和利尿剂在P组和G组中使用更频繁。

**3.2 血液学参数与单核细胞特征**

三组间总白细胞数量相似。P组患者中性粒细胞显著增加而淋巴细胞减少。G组单核细胞水平最高，但未达统计学显著性。进一步将单核细胞分为经典亚群（Mo1：CD14⁺⁺CD16^-）、中间亚群（Mo2：CD14⁺⁺CD16⁺）和非经典亚群（Mo3：CD14⁺CD16⁺⁺）后，G组在Mo1、Mo2和Mo3三个亚群的绝对细胞数上均最高。流式细胞术检测显示，三组间单核细胞表面共刺激分子CD86和MHC-Ⅱ类分子HLA-DR的平均荧光强度（MFI）均无显著差异。然而，G组PBMCs中CD28 mRNA表达较C组显著降低，P组也呈现降低趋势但未达统计学意义。

**3.3 体外淋巴细胞活化**

以SEB超抗原进行多克隆刺激后，G组CD4⁺CD69⁺CD137⁺和CD8⁺CD69⁺CD137⁺ T细胞频率较C组更高，提示肾功能减退患者具有较强的多克隆T细胞反应能力。SEB可交叉连接T细胞受体与抗原呈递细胞上的MHC-Ⅱ类分子，模拟广泛的适应性免疫应答。

**3.4 CMV和SARS-CoV-2抗原特异性T细胞活化**

以CMV和SARS-CoV-2特异性抗原刺激后，三组间CD4⁺和CD8⁺ T细胞的特异性应答频率均无显著差异。三组间CMV血清阳性率相当（P组69%、G组59%、C组50%）。在探索性分析中，将抗原特异性反应与SEB多克隆反应进行归一化后，G组CD4⁺ T细胞定向于CMV和SARS-CoV-2的比例呈现降低趋势（ANOVA CMV-CD4：p = 0.08），但未达统计学显著性，可能受限于队列规模较小。

**3.5 CXCL10和干扰素的表达**

qPCR检测显示，三组间CXCL10 mRNA表达水平无显著差异。同样，促炎性细胞因子IFN-γ和抗病毒因子IFN-α的mRNA表达在PBMCs中及血清蛋白水平上均无组间差异。

**3.6 CXCL10表达与抗原特异性免疫应答的相关性**

相关性分析显示，CMV特异性T细胞应答与IFN-γ mRNA表达显著相关，而CXCL10 mRNA表达与CMV和SARS-CoV-2特异性免疫应答均无显著相关性，提示在本研究人群中CXCL10并非合适的抗原特异性应答评估指标。

**四、讨论与结论**

研究结果表明，CKD相关的单核细胞及单核细胞亚群数量改变和淋巴细胞活化异常与eGFR降低相关，而非蛋白尿。G组中促炎性单核细胞亚群（尤其是与心血管疾病相关的Mo2）的升高，可能归因于该组更低的eGFR（较P组低约16 mL/min/1.73 m²）。关于共刺激通路，虽然既往研究报道肾衰竭患者存在B7-2信号缺陷，但本研究中三组CD86表达无差异。G组CD28 mRNA降低及SEB多克隆反应增强提示，肾功能减退患者可能处于一种非特异性免疫激活状态，这种背景性激活可能削弱T细胞对特异性抗原的应答能力。既往研究也提示尿毒症毒素在T细胞活化和功能障碍中起重要作用。此外，CKD中T细胞耗竭（PD-1和KLRG1表达增加、细胞因子产生受损）以及CD4⁺ T细胞亚群组成改变（如Treg/Th17比值降低）也被报道，但本研究未进行详细的T细胞亚群表型鉴定。

本研究存在一定局限性：各组患者数量较少，抗原特异性活化具有较高的个体间变异。此外，多克隆T细胞活化升高究竟是T细胞功能改变的结果还是循环中大量促炎性单核细胞的替代性解释，尚无法确定。

研究结论：eGFR降低（CKD G3-5期）的患者表现出单核细胞亚群数量和T细胞活化的异常，而严重蛋白尿（CKD A3期）患者则无此改变。因此，蛋白尿患者临床上表现出的高感染易感性需要通过其他机制加以解释。