《International Journal of Molecular Sciences》：Sperm DNA Fragmentation in Native Semen: A Reflection of Apoptotic and Non-Viable Spermatozoa and Its Implications for Assisted Reproduction
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精子DNA碎片化（SDF）被广泛用作男性生育力的生物标志物，尽管其对辅助生殖技术（ART）结局的预测价值仍存在争议。研究人员推测，这一差异反映了在传统SDF评估自然射出精液时纳入了非活力精子。研究人员回顾性分析了1394名男性的精液样本，以评估DNA碎片指数（
精子DNA碎片化（SDF）被广泛用作男性生育力的生物标志物，尽管其对辅助生殖技术（ART）结局的预测价值仍存在争议。研究人员推测，这一差异反映了在传统SDF评估自然射出精液时纳入了非活力精子。研究人员回顾性分析了1394名男性的精液样本，以评估DNA碎片指数（DFI）、精子活力、精子存活率和精子浓度之间的关联。此外，在一项前瞻性队列研究（n=11）中进行了活力门控的精子染色质结构分析（SCSA），并评估了密度梯度离心、上游法、微流控筛选和磁性激活细胞分选前后的DFI。自然射出精液DFI与精子存活率、活力和浓度呈显著负相关。活力门控分析显示，活力精子中的平均DFI比总射精精液低3.5倍（11.27% vs. 39.64%，p < 0.001）。所有精子制备方法均显著降低DFI，同时富集了活动力和活力较好的精子。这些研究结果表明，自然射出精液中检测到的SDF有相当大比例来源于非活力精子，自然射出精液DFI可能无法完全代表具有受精能力精子部分的DNA完整性，这为其在ART中预测价值有限提供了潜在的生物学解释。
论文解读：自然射出精液精子DNA碎片化的生物学本质及其在辅助生殖技术中的预测价值再评估
一、研究背景与问题提出
不孕症影响全球约8-12%的育龄夫妇，其中男性因素单独或共同导致的不孕病例占比高达50%。世界卫生组织（WHO）将不孕症定义为夫妇在规律无保护性交12个月以上未能实现临床妊娠。尽管常规精液分析是男性不育实验室评估的核心手段，但其在精子功能与遗传完整性方面提供的信息有限。相当一部分男性不育病例在精液参数正常的情况下仍无法解释病因，即所谓特发性男性不育。这一诊断缺口推动了补充性精子功能检测的发展，其中精子DNA碎片化（SDF）检测受到广泛关注。
SDF指精子核DNA中单链或双链断裂的存在，可通过精子染色质结构分析（SCSA）、精子染色质扩散试验（SCD）、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）及单细胞凝胶电泳（Comet）等技术进行量化。然而，自然射出精液中升高的DNA碎片指数（DFI）能否预测辅助生殖技术（ART）结局，文献报道存在显著争议。多项荟萃分析未能一致证明高自然DFI与体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）周期中临床妊娠率或活产率受损之间存在显著关联。
研究人员提出假设：这一矛盾现象可能源于常规自然射出精液SDF评估中包含了非活力精子。在ART临床实践中，受精过程从不直接使用未经处理的自然射出精液，而是需要经过精子制备步骤。如果精子处理系统地清除了携带DNA碎片化的凋亡精子，那么自然射出精液DFI测量值与最终ART结局之间的直接相关性自然会被削弱。本研究旨在通过大规模回顾性数据分析和前瞻性配对实验，直接检验这一假设。
二、研究设计与关键技术方法
本研究整合了多种实验设计与技术手段。回顾性分析纳入1394例连续精液分析数据，这些数据来源于Dunamenti REK Tapolca研究所截至2024年中期收集的样本，要求精子浓度、总活力、前向活力、存活率和DFI指标完整。前瞻性配对队列包含11例样本，用于比较总射精精液与活力门控精子亚群的DFI差异。精液样本按照WHO指南规定的禁欲期后通过手淫方式采集。
关键技术方法包括：SCSA法检测SDF，使用Cariad试剂系统和MACSQuant 16流式细胞仪，通过488 nm蓝色激光激发，检测双链DNA完整精子的绿色荧光（525 nm）和单链DNA断裂精子的红色荧光（680 nm）；活力门控分析采用Viobility 405/452 Fixable Dye标记膜完整性受损细胞；四种精子制备技术包括密度梯度离心（DGC）、上游法（SU）、磁性激活细胞分选（MACS）和ZyMōt微流控芯片分选。统计分析采用Kruskal-Wallis检验、单因素方差分析及Wilcoxon配对符号秩检验。
三、研究结果
3.1 DFI与1394例样本中精子功能参数呈负相关
回顾性分析显示，DFI < 25%的样本其精子浓度、总活力、前向活力和存活率显著高于DFI > 25%的样本（所有配对比较经Dunn事后校正后p < 0.0001）。Kruskal-Wallis整体检验结果显著（H = 5935；p < 0.0001；df = 11）。这表明自然射出精液中高DFI与常规精液参数受损之间存在强烈的样本水平关联。
3.2 活力门控精子DFI显著低于总自然射出精液
在11例配对样本中，总精子群体的平均DFI为39.64%，而活力门控亚群的平均DFI仅为11.27%，差异达3.5倍（Wilcoxon配对符号秩检验，p < 0.0001）。这一结果通过流式细胞术门控获得，未经过物理精子选择，直接证明自然射出精液中相当大比例的DNA碎片化信号来自非活力精子。值得注意的是，活力亚群仍保留了可测量的DFI，表明DNA损伤并非仅存在于非活力细胞中。
3.3 所有ART精子制备方法通过富集活动力和活力精子显著降低DFI
四种制备技术均显著降低DFI，同时提高活动力和存活率。ZyMōt微流控芯片实现了最大的DFI绝对降幅（从39.64%降至3.68%），同时产生最高的制备后活动力（94.36 ± 2.62%）和存活率（96.90 ± 1.42%）。上游法达到第二低的制备后DFI（10.14 ± 1.61%），MACS将DFI降至19.38 ± 11.55%，DGC产生最小降幅（33.90 ± 12.11%）。DFI降低效率排序为：ZyMōt芯片 > 上游法 > MACS > DGC，这与各方法对活动力依赖性选择的程度高度一致。
四、结论与讨论
本研究核心发现是自然射出精液中DFI与常规精子质量指标密切相关，且当分析限定于活力精子时DFI显著降低。配对流式细胞术队列中，活力门控精子的平均DFI（11.27%）远低于总自然射出精液群体（39.64%），且这一比较在无物理选择步骤的条件下获得，有力支持非活力精子对全样本水平DFI贡献巨大的解释。该发现与凋亡及相关细胞死亡通路是精子DNA损伤重要来源的既有认识一致。
研究结论明确三点：第一，基于1394例回顾性队列，自然射出精液中高DFI与活动力、存活率和浓度降低密切相关，提示碎片化与细胞非活力存在共同生物学起源；第二，配对活力门控队列中，分离活力亚群使平均DFI降低3.5倍，从全射精精液的39.64%降至活力细胞中的11.27%，表明自然射出精液中大部分碎片化信号来自永远不会使卵子受精的细胞；第三，所有测试的ART制备方法——密度梯度离心、上游法、磁性激活细胞分选和微流控选择——均降低DFI同时富集活动力和活力精子，且两种免离心技术（ZyMōt芯片和上游法）产生最大降幅。
由于ART中的受精总是使用已制备的活动精子部分而从不使用自然射出精液，制备前获得的DFI值描述的是不会参与受精的细胞，这为高自然DFI经常无法预测IVF或ICSI后妊娠或活产提供了合理的生物学解释。这并不否定SDF检测本身的价值，而是反对在不适当的阶段进行测量：评估经过处理的活动力富集样本比评估原始射精精液更具信息价值。对于制备后DFI仍高的少数男性群体，睾丸精子获取提供了一种合理且有针对性的选择。
本研究存在若干局限性：前瞻性活力门控分析样本量小（n = 11）且为单中心；回顾性队列仅在所有必需变量可用时纳入连续分析；未分析生殖结局；未同时测量凋亡标志物；研究基于SCSA方法学，可能不完全适用于基于不同分析原理的SDF检测方法。未来需要通过结合活力门控DFI测量与真实妊娠和活产数据的大规模前瞻性研究来进一步验证。
