壳聚糖-结冷胶纳米颗粒用于抗结核药物包封：合成、表征与体外研究

《Polymers》：Chitosan-Gellan Gum Nanoparticles for Antituberculosis Drug Encapsulation: Synthesis, Characterization and In Vitro Investigation

　　

结核病（Tuberculosis, TB）仍是全球致死性传染病之一，一线药物异烟肼（Isoniazid, INH）因快速代谢与肝毒性限制了其疗效。研究人员提出以天然多糖通过静电作用形成聚电解质复合物（Polyelectrolyte Complex, PEC）的策略，开发可吸入黏膜黏附纳米载体，以提升肺部局部药物浓度并降低全身副作用。本研究采用聚电解质复合凝聚法，以阳离子壳聚糖（Chitosan, CS）与阴离子结冷胶（Gellan Gum, GG）构建CSGG纳米颗粒（Nanoparticles, NPs），包封INH（CSGG–INH NPs）。研究人员考察了壳聚糖/结冷胶质量比与介质pH对粒径、多分散指数（Polydispersity Index, PDI）、表面电势（Zeta Potential）、载药量（Drug Loading, DL）及包封率（Encapsulation Efficiency, EE）的影响；通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）与纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）确认形貌为球形纳米级粒子；以羊肺组织荧光滞留实验评价黏膜黏附性；在生理条件（磷酸盐缓冲液pH 7.4，37 °C）下考察体外释放；采用分枝杆菌生长指示管（Mycobacteria Growth Indicator Tube, MGIT）系统联合L?wenstein–Jensen培养基传代评估对结核分枝杆菌H37Rv的抑菌活性。结果显示，优化配方（CS:GG=4:6，pH 2）粒径约178 nm，EE达32%，DL达61%，Zeta电位+22 mV；颗粒在羊肺组织经500 mL磷酸盐缓冲液冲刷后仍保留强荧光，表现高黏膜黏附；释放呈初始突释后24 h持续释放，Korsmeyer–Peppas模型拟合最佳（n=0.226，扩散主导）；MGIT体系中所有测试浓度（INH当量10–80 mg）均完全抑制H37Rv生长；卤虫幼虫急性毒性实验表明包封后INH毒性降低（游离INH LC50=352 μg/mL，纳米粒LC50>1000 μg/mL）。研究表明CSGG–INH NPs具备持续释药、肺黏膜黏附及高效抗分枝杆菌活性，可作为异烟肼肺部递送的潜在载体。

研究背景方面，结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起，2024年全球约1070万新发感染、123万死亡。一线治疗依赖异烟肼、利福平、吡嗪酰胺与乙胺丁醇，其中异烟肼在杀菌初期效果突出，但易快速代谢且具肝毒性。聚合物纳米颗粒可提升吸收部位蓄积并靶向递送，多糖基聚电解质复合物（PEC）凭借生物可降解、无外加交联剂、参数可调等优势成为热点。壳聚糖（CS）带正电具黏膜黏附与pH敏感释药特性，结冷胶（GG）带负电可稳定网络并减缓低pH突释，二者既往多被研为水凝胶，关于CSGG PEC纳米颗粒包封抗结核药并评价肺黏附的研究尚不充分。本研究即在此缺口下，系统优化乙醇辅助复合凝聚工艺，制备黏膜黏附型CSGG–INH纳米粒。

关键技术方法上，研究人员以低分子量壳聚糖（50–190 kDa，脱乙酰度≥75%）与低酰基结冷胶为材料，在pH 2或5、CS:GG=9:1至1:9范围内通过60 °C滴加GG于CS溶液、再滴加90%乙醇并降温至25 °C的复合凝聚法成粒，离心收集；以动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测粒径/PDI、电泳多普勒测Zeta电位；TEM与NTA观形貌；傅里叶变换红外光谱（Fourier-Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）析相互作用；热重分析（Thermogravimetric Analysis, TGA）与差示扫描量热（Differential Scanning Calorimetry, DSC）察热行为与晶态；透析法（磷酸盐缓冲液pH 7.4，37 °C）评释放并用零级/一级/Higuchi/Korsmeyer–Peppas模型拟合；以FITC标记CS制备荧光粒，在羊肺组织（2×2 cm²块，45°倾斜，2 mL/min磷酸盐缓冲液冲刷至500 mL）用ImageJ定量黏膜滞留；抗菌实验采用MTB H37Rv敏感株（源自Asclepios肺科诊所，慕尼黑），经MGIT液体培养25天并转种L?wenstein–Jensen固体培养基4周计菌落；毒性实验以卤虫（Artemia salina）蚤状幼体24 h存活率算LC₅₀。样本队列来源明确为羊肺组织与MTB H37Rv临床敏感株。

研究结果部分，3.1节合成与表征显示：pH 2时粒径214–358 nm，C4G6配方（CS:GG=4:6）粒径最小（214±15 nm）、产率63%、Zeta+28 mV；pH 5时C2G8配方产率73%但包封偏低；载药后C4G6-INH粒径178±7 nm、EE 32%、DL 61%、Zeta+22 mV，优于C2G8-INH-pH5（EE 18%），故选C4G6-pH2为主方。3.2节理化物性中，TEM见球形负染颗粒（电镜均径306±69 nm，略大于DLS因干燥扁平），NTA确认148–215 nm分散好；FTIR中1725 cm^?1新峰与1632 cm^?1位移证CS–GG分子间作用，载入INH后3430/1647 cm^?1微移证药物–基质作用；DSC/TGA示纯INH在171 °C有熔融吸热峰，而CSGG–INH中该峰消失，表明INH以无定形分子分散，且热稳定性提升。3.3节黏膜黏附研究示FITC–CS、FITC–CSGG、FITC–CSGG–INH在500 mL磷酸盐缓冲液冲刷后荧光保留无统计学差异（p>0.05），证GG与INH包封不损CS正电氨基与黏蛋白负电相互作用。3.4节体外释放呈双相，24 h累积释放>20%，Korsmeyer–Peppas拟合最优（R²=0.836，n=0.226），属Fick扩散主导。3.5节抗分枝杆菌实验，空白CSGG及无药对照MGIT中H37Rv茂密生长且齐尔–尼尔森染色阳性，而CSGG–INH在INH当量10–80 mg各浓度转种后均无生长，证持续释药全程抑菌。3.6节毒性中游离INH使卤虫死亡率14%（0.1 mg/mL）至78%（1 mg/mL），LC₅₀=352 μg/mL；CSGG–INH同浓度下死亡率7.2–10.5%，LC₅₀>1000 μg/mL，包封显著降低急性毒。

讨论与结论部分，研究人员指出乙醇辅助复合凝聚可在无特殊设备下制得稳定CSGG PEC纳米粒，酸性pH与CS稍过量（4:6）利于致密网络与高EE；肺部递送场景下，粒径~178 nm适肺沉降，正Zeta减少肺泡巨噬快速清除，黏膜黏附延长驻留，双相释放匹配初期表面药突释与后期基质扩散，MGIT长期抑制证释药维持治疗浓度。结论译文如下：本研究成功合成并表征了负载异烟肼的黏膜黏附型壳聚糖–结冷胶聚电解质复合物纳米颗粒（CSGG–INH NPs），评价其作为异烟肼肺部递送载体之潜力。通过调控壳聚糖/结冷胶比例与pH获最优配方，具粒径178±7 nm、PDI 0.269±0.025、Zeta电位+22±3 mV、载药量61%、产率26%等优良理化性质；TEM与NTA确证球形纳米结构，FTIR、DSC、TGA证基质形成与INH无定形包封；羊肺组织动态冲刷下表现高黏膜黏附；pH 7.4磷酸盐缓冲液中呈突释–缓释双相；MGIT体系完全抑制H37Rv生长；卤虫实验示包封后INH毒性降低（游离LC₅₀=352 μg/mL，纳米粒LC₅₀>1000 μg/mL）。该载体集高黏附、缓释与抑菌活性于一体，支持其作为异烟肼肺部递送纳米载体进一步深化气溶胶性能、肺沉积、药代与体内疗效研究。论文发表于《Polymers》。