核心昼夜节律钟基因调控Parhyale hawaiensis的分子与行为近日潮汐节律

《Current Biology》：Core circadian clock genes control molecular and behavioral circatidal rhythms in Parhyale hawaiensis

　　

海洋生物表现出与潮汐线索同步的12.4小时基因表达、生理和行为节律。这些近日潮汐节律背后的机制及其与昼夜节律钟机制的重叠程度一直难以阐明。然而，近期研究表明，核心昼夜节律基因BMAL1在甲壳动物中维持近日潮汐行为。因此，研究人员对海洋端足类动物Parhyale hawaiensis中的另外三个核心昼夜节律钟基因（PhCry2、PhPer和PhClk）进行了突变。研究发现它们对昼夜节律和近日潮汐行为均为必需。此外，所有四个核心昼夜节律基因对于昼夜节律脑神经元中mRNA水平的24小时振荡和近日潮汐神经元中的12.4小时mRNA节律均至关重要。出乎意料的是，突变体分析表明，PhCLK在近日潮汐神经元中独立于PhBMAL1抑制PhPer表达。该研究因此揭示了昼夜节律钟和近日潮汐钟共享四个核心分子组分，但其转录布线不同。

**论文解读：核心昼夜节律钟基因共同调控Parhyale hawaiensis的昼夜节律与近日潮汐节律**

**一、研究背景与科学问题**

生物钟是生物体为适应环境周期性变化（如昼夜更替、潮汐涨落）而演化出的内在计时机制。昼夜节律钟（circadian clock）是其中研究最深入的一种，其核心机制在动物中高度保守，由转录-翻译负反馈环路构成：CLOCK（CLK）与BMAL1形成异源二聚体，结合至E-box元件并激活下游基因转录，其中包括编码自身抑制因子PERIOD（PER）和CRYPTOCHROME（CRY）的基因。然而，潮间带生物还面临潮汐周期（约12.4小时）带来的环境变化，并相应表现出近日潮汐节律（circatidal rhythm）。与昼夜节律钟相比，近日潮汐钟的分子机制长期缺乏明确认识。早期研究提出三种假说：其一认为昼夜节律与近日潮汐节律由各自独立的时钟驱动；其二认为二者源于同一个时钟，可根据环境线索以约24小时或约12.4小时周期运行；其三则提出由两个反相运行的约24.8小时近日月节律钟（circalunidian clock）共同产生潮汐节律输出。近期的RNA干扰（RNAi）实验在蟋蟀（Apteronemobius asahinai）和等足类动物（Eurydice pulchra）中提示Clk、Per和Cry2可能不参与维持近日潮汐节律，但药理学实验显示酪蛋白激酶Iε（casein kinase Iε）同时参与两类节律调控。更重要的是，CRISPR-Cas9介导的PhBmal1敲除彻底消除了端足类动物Parhyale hawaiensis的近日潮汐行为，且在该物种脑中鉴定出独立的昼夜节律神经元与近日潮汐神经元群体。这为在同一生物中系统解析两类时钟的分子组分重叠程度及转录调控差异提供了关键模型。因此，研究人员对PhPer、PhClk和PhCry2三个核心昼夜节律基因进行敲除，以检验昼夜节律钟与近日潮汐钟在分子机制上的重叠程度及其转录布线差异。

**二、研究结论与意义**

该研究表明，PhCry2、PhPer和PhClk与先前报道的PhBmal1一样，均为维持P. hawaiensis昼夜节律行为与近日潮汐行为所必需，证明两类时钟共享四个核心分子组分。分子水平上，这四个基因分别维持昼夜节律脑神经元（medioposterior，MP）中约24小时和近日潮汐神经元（dorsal-lateral，DL）中约12.4小时的PhPer与PhCry2 mRNA节律。更重要的是，研究发现PhCLK在近日潮汐神经元中特异性发挥对PhPer的抑制功能，且该功能不依赖PhBMAL1，这与PhCLK在昼夜节律神经元中作为转录激活因子的经典功能形成鲜明对比，揭示了两类时钟在转录布线上的根本差异。该发现支持了Naylor提出的昼夜节律钟与近日潮汐钟相互独立的模型，同时也提示二者共享核心组分但通过差异化的转录调控实现不同周期振荡。该研究为理解生物如何利用有限的核心时钟组分应对多个环境周期提供了重要范式。该论文发表在《Current Biology》。

**三、主要关键技术方法**

研究人员使用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，针对PhCry2、PhPer和PhClk基因的功能域设计双向导RNA（guide RNA，gRNA），在P. hawaiensis中分别建立了多个独立敲除突变系，并通过Sanger测序确认突变位点。物种来源为芝加哥F品系（Chicago-F strain）。采用Drosophila活动监测系统（DAM）对动物游泳行为进行长时间记录与分析，结合χ2周期图与自相关分析判定节律性与周期。运用HCR-FISH（hybridization chain reaction fluorescence in situ hybridization，杂交链式反应荧光原位杂交）技术检测脑内PhPer与PhCry2 mRNA的时空表达动态。此外，在HEK-293T细胞中开展基于荧光素酶报告基因的转录活性检测实验，验证PhPER与PhCRY2对PhBMAL1/mCLK转录活性的抑制作用及截短突变体功能的丧失。

**四、研究结果**

**1. PhCry2缺失破坏昼夜节律**

研究人员通过CRISPR-Cas9构建了两个PhCry2敲除系，截短突变体均缺失大部分光裂解酶结构域和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合域。细胞转录实验表明，截短的PhCRY2完全丧失对PhBMAL1/mCLK介导转录的抑制能力，而野生型PhCRY2能以剂量依赖方式抑制转录且为主要抑制因子，PhPER仅起辅助调节作用。行为学实验显示，在持续光照（LL）和持续黑暗（DD）条件下，PhCry2纯合突变体的昼夜节律行为均严重受损，多数动物呈现无节律状态，少数保留弱节律的个体周期也偏离正常范围。分子水平上，HCR-FISH检测发现PhCry2突变体MP昼夜节律神经元中PhCry2 mRNA持续低表达，PhPer mRNA表达显著升高且失去正常的24小时节律振荡。

**2. PhCry2是近日潮汐钟的关键组分**

在同时给予光暗（LD）循环和潮汐（10.3小时高潮位：2.1小时低潮位）循环驯化后，于DD和持续高潮位条件下监测行为。野生型和杂合子动物表现出明显的近日潮汐节律，在预期高潮位时活动增强；而PhCry2纯合突变体完全丧失节律性活动。杂合子动物的潮汐节律周期较野生型显著延长，提示存在基因剂量效应。分子水平上，DL近日潮汐神经元中PhCry2 mRNA在突变体中持续低水平，PhPer mRNA虽呈现时间依赖性降低但无残余潮汐节律。这些结果表明PhCRY2为近日潮汐节律所必需。

**3. PhPer缺失破坏昼夜节律**

研究人员建立了三个PhPer敲除系，所有截短突变均位于PAS（Per-ARNT-Sim）结构域之前，导致PhPER蛋白缺失两个PAS结构域和PAC（Per-ARNT-carboxy-terminal）结构域。细胞实验证实截短的PhPER不能辅助PhCRY2发挥转录抑制作用。行为学结果显示，在LL条件下PhPer纯合突变体的昼夜节律行为显著受损，DD条件下仅72只中4只动物保留节律性。MP神经元中PhCry2和PhPer mRNA的24小时节律均被破坏，mRNA水平随时间递减而非呈现节律性峰值。

**4. PhPer支持近日潮汐行为**

经LD与潮汐联合驯化后，PhPer纯合突变体表现出微弱且快速衰减的近日潮汐活动节律，该残余节律可随潮汐相位6小时平移而相应移动，证明其确实受潮汐线索驱动。但节律性动物比例较野生型和杂合子显著降低，少数节律性个体的周期和强度与野生型无显著差异。DL神经元中PhPer和PhCry2 mRNA均无显著的12.4小时节律性变化，但两者在野生型表达高峰时间点略有升高，提示可能存在微弱残余分子节律。这说明PhPer虽然重要，但其缺失并不完全消除近日潮汐行为，其必要性低于PhCry2。

**5. PhClk也为昼夜节律所必需**

研究人员在基因组中鉴定出PhClk的两个推定PAS-A编码外显子，并针对bHLH结构域设计了gRNA，获得两个截短突变系。行为学实验显示，LL条件下PhClk纯合突变体节律性动物比例下降但未达显著水平，少数弱节律个体的周期分散而不再聚集于25.5小时；DD条件下所有敲除动物均无节律。MP神经元中PhPer和PhCry2 mRNA的24小时节律消失，PhCry2表达水平极低。

**6. PhClk支持近日潮汐行为**

PhClk纯合突变体在潮汐驯化后仅表现出约2个周期的微弱潮汐节律性活动，节律性动物比例和节律强度显著低于野生型与杂合子，残余活动的相位与潮汐预期一致。DL神经元中PhPer和PhCry2 mRNA虽可检测到但均无时间依赖性变化：PhPer mRNA持续高表达，PhCry2表达水平持续偏低。

**7. PhBMAL1功能与PhCLK在近日潮汐神经元中的差异**

对PhBmal1敲除动物的HCR-FISH分析显示，MP神经元中PhPer和PhCry2的mRNA节律均被破坏，表达水平持续低平；DL神经元中两种mRNA也均无潮汐节律。这证明PhBMAL1同时参与两类时钟的分子调控。然而，在PhClk突变体的DL神经元中观察到一种出乎意料的现象：PhCry2 mRNA水平很低（符合其激活因子缺失的预期），但PhPer mRNA水平却持续处于峰值状态。这提示PhCLK在近日潮汐神经元中对PhPer起抑制作用而非激活作用，且该功能不依赖PhBMAL1。研究人员通过同时处理野生型和突变体样本的重复实验排除了批次效应，确认了这一发现。

**五、总结与讨论**

作者指出，该研究与此前在E. pulchra和A. asahinai中RNAi实验结果不一致，可能原因包括RNAi未能充分抑制基因表达，或不同海洋生物中近日潮汐计时机制存在趋同或趋异进化。在P. hawaiensis中，PhCRY2和PhBMAL1的缺失完全破坏分子与行为潮汐节律，而PhPER和PhCLK缺失后仍存在微弱的残余潮汐行为，说明二者为潮汐钟的重要组分但可能并非绝对必需，其他bHLH/PAS转录因子（如PhHIFα）可能发挥部分代偿作用。

研究人员发现，在昼夜节律神经元中PhPer与PhCry2 mRNA呈反相振荡，而在近日潮汐神经元中二者为同相振荡，表明两类神经元中时钟基因的转录调控网络布线不同。突变分析进一步揭示：PhBMAL1在两类神经元中均作为转录激活因子发挥作用；PhCLK在昼夜节律神经元中作为激活因子，但也可与PhBMAL1以外的伙伴合作维持PhCry2的基础转录水平；而在近日潮汐神经元中，PhCLK则独立于PhBMAL1抑制PhPer转录。这一新型功能可能是理解两类时钟以显著不同周期振荡的关键。

**研究结论**：该研究揭示，在P. hawaiensis中，同时追踪几乎互为谐波但并不完全等价的潮汐与昼夜环境振荡的进化解决方案，是利用同一组核心时钟基因分别存在于两群不同的起搏神经元中，通过不同的自调控反馈环路设定各自的特异性周期。昼夜节律钟与近日潮汐钟的这种空间分离，使P. hawaiensis能够整合昼夜与潮汐线索，适应不同潮汐模式（半日潮、混合潮和全日潮）的环境。该工作增进了对生物应对复杂环境周期性的精密机制的理解。