《Molecules》：Whole-Genome Sequence Dataset of Rhodococcus qingshengii IEGM 267—Terpenoid Biotransformer Toward Genetic Functional Annotation
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摘要翻译：
背景/目标：单萜类化合物的微生物生物转化是获取生物活性化合物的一种有前景的方法。红球菌属物种因其代谢多样性和转化疏水性底物的能力而成为有吸引力的生物催化剂。在本研究中，研究人员考察了Rhodococcus qingshengii IEGM 267对
摘要翻译：
背景/目标：单萜类化合物的微生物生物转化是获取生物活性化合物的一种有前景的方法。红球菌属物种因其代谢多样性和转化疏水性底物的能力而成为有吸引力的生物催化剂。在本研究中，研究人员考察了Rhodococcus qingshengii IEGM 267对香芹烯醇异构体的催化潜力，并探索了可能支撑该活性的基因组特征。方法：将该菌株在以(?)-反式-香芹烯醇为补充的矿物质培养基中培养。生物转化产物通过薄层色谱（TLC）和气相色谱-质谱联用（GC–MS）进行分析。采用标准生物信息学工具对草图基因组进行测序、组装、分类学归属和注释。结果：Rhodococcus qingshengii IEGM 267高效地将(?)-反式-香芹烯醇转化为香芹酮。基因组分析确认了该菌株的分类学归属，并揭示了一个庞大的氧化还原酶库，包括单加氧酶、羟化酶和脱氢酶。鉴定出七个编码细胞色素P450依赖性加氧酶的基因，作为可能参与香芹烯醇氧化的候选酶。结论：R. qingshengii IEGM 267是(?)-反式-香芹烯醇氧化的高效且具有立体选择性的生物催化剂。生物信息学分析结果表明该转化可能存在替代性酶学基础，并为未来的功能表征奠定了基础。
论文解读文章：
**一、研究背景与科学问题**
萜类化合物是植物来源的天然产物大家族，其中单萜类化合物因其多样的生物活性而在医药和香料工业中具有重要价值。利用微生物对廉价易得的植物萜类原料进行结构修饰，以获取具有潜在药理活性的高附加值衍生物，是当前生物技术领域的研究热点之一。(?)-香芹烯醇作为一种单萜类化合物，是合成新型生物活性物质的重要起始原料，其微生物转化具有广阔的应用前景。在萜类转化微生物中，红球菌属（Rhodococcus）放线菌因其广泛的代谢能力和对疏水性底物的优异耐受性而备受关注。然而，尽管已有研究报道了若干红球菌株对萜类化合物的转化能力，但相关转化途径的遗传基础和关键酶学机制仍未被充分阐明，这限制了该类菌株在生物催化领域的深入应用。
Rhodococcus qingshengii IEGM 267是从俄罗斯彼尔姆地区石油污染土壤中分离获得的一株红球菌。此前研究已证实该菌株能够高效转化二萜类化合物脱氢枞酸（500 mg/L），并生成多种新型代谢产物。然而，该菌株对单萜类化合物的转化能力及其遗传基础尚未得到系统研究。针对这一科学空白，本研究旨在评估R. qingshengii IEGM 267对(?)-反式-香芹烯醇的催化转化潜力，并通过全基因组测序和生物信息学分析，鉴定参与该转化过程的关键候选基因，为后续的功能验证和酶学表征奠定基础。
**二、研究内容与主要技术方法**
研究人员对R. qingshengii IEGM 267进行了系统的生物转化活性评价和基因组学分析。在生物转化实验中，将该菌株在以(?)-反式-香芹烯醇为唯一碳源的矿物质培养基中培养7天，采用薄层色谱（TLC）和气相色谱-质谱联用（GC–MS）对转化产物进行定性和定量分析。在全基因组测序方面，使用Illumina HiSeq 2500平台对该菌株进行测序，利用SPAdes软件进行基因组组装。生物信息学分析采用多种标准工具，包括：TYGS平台进行基于全基因组的分类学分析；RAST系统进行基因组功能注释；antiSMASH预测生物合成基因簇；BLASTP搜索同源蛋白序列。菌株来源于俄罗斯彼尔姆地区石油污染土壤，由区域专性烃氧化微生物保藏中心（IEGM，WFCC编号285，WDCM编号768）保藏。
**三、研究结果与分析**
**3.1 生物转化活性**
研究发现，R. qingshengii IEGM 267在含有(?)-反式-香芹烯醇的培养基中培养7天后，实现了95%的生物转化产率，主要产物鉴定为香芹酮。香芹酮是一种具有重要工业应用价值的化合物，广泛应用于香料工业，并具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等生物活性。值得注意的是，该菌株将(?)-反式-香芹烯醇立体特异性氧化为香芹酮后，产物未被进一步转化，表明该氧化过程可能通过一条与已知途径不同的代谢通路进行。对比而言，R. erythropolis DCL14中香芹烯醇向香芹酮的转化由香芹烯醇脱氢酶（CDH）催化，而R. opacus PWD4中香芹酮仅为次要产物，说明不同红球菌株的转化模式存在显著差异。
**3.2 生物信息学分析**
基因组测序和组装结果显示，R. qingshengii IEGM 267的基因组大小为7.2 Mbp，包含231个重叠群，N50为173,729 bp，GC含量为62.3%，平均测序覆盖度为84.4×。基因组注释共鉴定出7,212个编码序列（CDSs）和56个RNA基因。基于数字DNA-DNA杂交（dDDH）和平均核苷酸一致性（ANI）分析，确认该菌株属于R. qingshengii物种。功能注释结果揭示了一个丰富多样的氧化还原酶库，包括76个单加氧酶基因、41个双加氧酶基因、11个羟化酶基因和386个脱氢酶基因。此外还鉴定出5个参与非甲羟戊酸途径的异戊二烯生物合成酶基因，以及2个萜烯生物合成基因簇。基因组挖掘发现，该菌株中不存在已知的limC基因（编码CDH），且BLASTP搜索未能鉴定到CDH的同源蛋白。然而，研究人员鉴定了7个编码细胞色素P450依赖性加氧酶的候选基因，这些基因可能作为limC的潜在同源物或类似物参与香芹烯醇的氧化。对P450基因侧翼序列的分析表明，这些基因多与氧化还原代谢基因、转运蛋白和转录调控因子组成功能特化的基因簇，其中5个基因上游存在AcrR家族调控因子，暗示其可能响应芳香族化合物或外源物质的诱导。值得注意的是，CYP450 No. 3的氨基酸序列与R. kyotonense、R. cerastii的P450细胞色素呈100%一致性，尤其与R. fascians的芳樟醇8-单加氧酶高度一致，表明该酶可能参与萜类化合物的转化过程。成对氨基酸序列比对结果显示，这7个P450酶与CDH的一致性不超过32%，提示它们可能编码先前未被描述的P450酶。
**四、讨论与结论总结**
讨论部分指出，尽管生物信息学分析为(?)-反式-香芹烯醇生物转化的遗传基础提供了有价值的见解，但研究存在一定局限性：功能注释基于参考数据库的同源搜索，可能无法完全覆盖酶的功能多样性；大量的预测编码序列被注释为假定蛋白或功能未知蛋白，反映了数据库覆盖度的不足；从基因组数据中无法仅凭信息学分析确定各候选酶在实际生物转化中的贡献。因此，定向实验验证（包括基因敲除、转录组分析、异源表达和体外酶活测定）对于明确鉴定候选酶的功能至关重要。本研究的主要结论可概括为：Rhodococcus qingshengii IEGM 267是(?)-反式-香芹烯醇氧化为香芹酮的高效且具有立体选择性的生物催化剂，培养7天即可获得高转化产率。基因组测序和注释确认了该菌株的分类学归属，揭示了一个富含氧化还原酶的代谢多功能基因组，包括单加氧酶、羟化酶、脱氢酶和7个细胞色素P450依赖性加氧酶。值得注意的是，预测蛋白质组中未鉴定到可识别的CDH同源物，提示该菌株中香芹烯醇氧化由替代性酶系统介导。在候选基因中，CYP450 No. 3因其与萜类相关单加氧酶的高度序列保守性而被认为是最具前景的功能表征研究对象。本研究的发现拓展了红球菌介导的萜类生物转化的知识体系，为未来香芹烯醇氧化关键酶的实验验证和功能解析奠定了坚实的基因组学基础，具有重要的基础研究价值和潜在的应用前景。
