一种用于表征伴有眼内炎症的非人灵长类动物眼组织切片中免疫细胞的多重免疫染色方法

《Journal of Histotechnology》：A multiplex immunostaining method for characterization of immune cells in non-human primate ocular tissue sections with intraocular inflammation

　　

在非临床研究中，向非人灵长类（NHP）眼睛施用生物制剂可能导致个别动物出现散发性眼内炎症（IOI）。当生物制剂是人类（外源）蛋白且施用于NHP时，理解IOI的病因及其临床相关性尤为困难，并构成了推进眼部生物疗法开发所需的重要数据缺口。本研究描述了一种旨在满足这一需求的多重免疫染色检测方法的开发与验证。该方法包含六种标志物，可区分T细胞（CD4⁺、CD8⁺）、调节性T细胞（CD4⁺、FoxP3⁺）、B细胞（CD20⁺）、巨噬细胞（CD68⁺），以及M2型巨噬细胞和小胶质细胞（CD68⁺、IBA1⁺）。在代表性眼部样本中，生物制剂诱导的IOI初步结果证明了该检测方法能够识别存在的免疫细胞类型及其空间关系，从而显著增强对IOI免疫学基础的理解。这增加了有价值的解释性信息，有助于做出更优决策以开发安全有效的疗法。

**论文解读文章**

**研究背景**
眼内炎症（IOI）是眼科药物开发中常见的并发症，可由多种因素触发。在生物制剂给药后，IOI的机制可能涉及急性无菌性炎症和炎性血管炎，患者特异性、药物特异性和给药方式特异性因素均发挥作用。此外，对治疗性药物的全身免疫反应可能因并发炎症和/或自身免疫性疾病（如结节病、克罗恩病）而加剧，这些疾病可由任何免疫刺激（如疫苗接种、病毒暴露、过敏）触发，进而可能导致IOI。在临床前阶段，IOI可能由新化合物的未预见毒性、制剂中的赋形剂或防腐剂、杂质或蛋白质聚集体引发的固有免疫反应，以及生物制剂对非人灵长类（NHP）的外源性蛋白引发的适应性免疫反应引起。眼内给药（尤其是玻璃体内注射）对制剂中的任何成分均敏感，这些成分可能作为佐剂增强免疫原性。因此，需要一种强大的组织学工具包来区分免疫反应类型（适应性免疫与固有免疫），以帮助确定IOI的来源及其临床相关性。多重免疫染色检测方法可在同一组织切片中同时检测多种免疫标志物，从而在有限眼部样本中实现更全面的免疫谱分析。然而，现有文献中成功应用于眼组织（尤其是常规福尔马林固定石蜡包埋样本和NHP模型）的多重染色方案较少，这构成了转化研究和临床前研究的重要空白。本研究旨在开发并验证一种专为NHP眼组织设计的多重免疫染色检测方法，以推进IOI的免疫特征分析。

**研究内容与结论**
研究人员开发并验证了一种六重免疫荧光染色检测方法，包含CD4、CD8、CD20、FoxP3、CD68和IBA1六种标志物，用于表征NHP眼组织切片中的免疫细胞。该方法在三个案例研究中成功应用：案例1（系统性给药后出现脉络膜血管异常）显示浸润细胞主要为IBA1⁺/CD68⁺巨噬细胞，缺乏CD20⁺和FoxP3⁺细胞，提示为固有免疫反应；案例2（玻璃体内重复注射后出现注射部位炎症）显示大量CD4⁺和CD20⁺细胞，伴随少量巨噬细胞，符合适应性免疫应答的特征；案例3（脉络膜上腔注射腺相关病毒载体后出现脉络膜和巩膜浸润）显示混合的巨噬细胞、T细胞和B细胞浸润，但FoxP3⁺调节性T细胞稀少，提示免疫原性反应。该研究证明了多重免疫染色在区分IOI免疫机制方面的价值，为生物制剂安全性评估提供了重要工具。论文发表在《Journal of Histotechnology》。

**关键技术与方法**
研究采用Akoya PhenoCode? Signature Panel（PSP）免疫谱分析试剂盒，该试剂盒使用条形码化抗体和Opal试剂，实现了六重免疫荧光检测。研究人员对试剂盒进行了定制：将CD3e替换为CD4和CD8，将PanCK替换为IBA1，并添加了FoxP3抗体。主要技术流程包括：Davidson氏固定液固定的NHP眼组织石蜡切片（4 μm），使用Leica BOND Rx自动染色仪进行抗原修复（ER2，20分钟），随后采用一步法孵育抗体混合物（室温1小时），通过Opal-TSA荧光放大技术进行检测，最后在PhenoImager? HT平台上进行多光谱成像，并使用PhenoChart1.1.0进行光谱解混。样本来源包括三个不同研究中的NHP眼组织（分别来自静脉注射、玻璃体内注射和脉络膜上腔注射生物制剂的动物），并以NHP扁桃体和脾脏作为阳性对照组织。

**研究结果**
**阳性对照**：在Davidson氏固定的NHP扁桃体和脾脏中，所有六种抗体均检测到正确的细胞定位和表达模式，证实了试剂的选择性。
**CD8抗体**：最初使用的Akoya PSP人源CD8抗体在NHP组织中免疫反应性弱，尤其在多重染色中无法检测。改用Cell Signaling Technology的兔单克隆CD8抗体（克隆D8A8Y）后成功检测到CD8⁺细胞。
**检测系统选择**：Roche显色多重检测系统因NHP眼组织中的天然黑色素与DAB显色剂颜色相似，且六重检测中青色和绿色信号难以区分而被放弃。Akoya经典多重免疫荧光方法虽灵活但优化复杂，最终选用Akoya Signature Panel以简化流程。
**案例研究1**：NHP眼在静脉注射Fc功能化人单克隆抗体后出现脉络膜血管异常。H&E染色显示异常血管周围有单核细胞浸润。多重染色显示这些细胞主要为IBA1⁺和CD68⁺，少数CD4⁺，但无CD20⁺或FoxP3⁺细胞，提示为固有免疫反应（巨噬细胞介导）。
**案例研究2**：NHP眼在玻璃体内第二次注射人单克隆抗体7天后出现IOI。多重染色显示注射部位浸润细胞中CD4⁺和CD20⁺细胞占优势，同时存在少量CD68⁺和IBA1⁺细胞，符合适应性免疫应答（细胞和体液免疫激活）的特征。
**案例研究3**：NHP眼在脉络膜上腔单次注射AAV2/8载体（含转基因蛋白）6周后出现脉络膜和巩膜浸润。多重染色显示浸润细胞包括CD4⁺ T细胞、CD20⁺ B细胞和大量IBA1⁺/CD68⁺巨噬细胞，FoxP3⁺细胞稀少，提示免疫原性反应涉及固有和适应性免疫。

**讨论与结论**
讨论部分指出，多重免疫表型分析为IOI的异质性提供了机制性背景。案例1中巨噬细胞主导而缺乏淋巴细胞，表明IOI并非由抗原性免疫反应引起；案例2中CD4⁺和CD20⁺细胞丰富，符合抗药物免疫驱动的适应性反应；案例3中巨噬细胞与T/B细胞混合，符合基因治疗相关炎症的混合免疫通路。研究还强调了Davidson氏固定液对眼组织形态保存的优势，以及使用人源抗体在NHP组织中可能遇到的交叉反应性问题（如CD8抗体克隆替换）。此外，讨论了多光谱成像中信号串扰问题及其缓解方法，如调整抗体浓度和重新平衡信号。Akoya PhenoCode Signature Panel的优势包括高效工作流程、条形码抗体的特异性和灵活性，以及一步法协议对脆弱眼组织的保护。该多重检测方法通过同时检测T细胞、B细胞、巨噬细胞和小胶质细胞标志物，实现了全面的免疫谱分析，有助于区分IOI的免疫机制，从而支持临床前开发中的候选药物选择、制剂优化和给药方案设计，降低免疫原性和毒性风险。

**结论**：研究人员开发并验证了一种在NHP眼组织中包含CD4、CD8、CD20、FoxP3、CD68和IBA1标志物的多重免疫细胞面板免疫组化（IHC）检测方法，为研究生物制剂眼部给药后眼内炎症的潜在原因提供了重要工具。