《Microorganisms》：TypA Interacts with ExsA to Suppress Type III Secretion System in Pseudomonas aeruginosa
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种医院获得性致病菌，可引起多种人类感染性疾病。III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）是该菌在急性感染中致病性的关键毒力决定因子。作为T3SS的主转录激活
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种医院获得性致病菌，可引起多种人类感染性疾病。III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）是该菌在急性感染中致病性的关键毒力决定因子。作为T3SS的主转录激活因子，ExsA结合靶标启动子区域，调控目前所有已鉴定的T3SS基因的表达。在本研究中，研究人员将酪氨酸磷蛋白A（tyrosine phosphoprotein A, TypA）鉴定为限制P. aeruginosa中T3SS表达的阻遏蛋白。TypA与ExsA相互作用，阻断ExsA与其靶标启动子的结合，从而抑制T3SS表达。研究显示，typA的表达受低钙、低温、生物被膜生活方式及与宿主细胞直接接触的诱导。此外，TypA缺失导致P. aeruginosa在低温下出现生长缺陷。综上，这些数据证实了TypA的重要作用，并揭示了P. aeruginosa调控T3SS的一种新型分子机制。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是常见的医院获得性致病菌，可引起囊性纤维化、烧伤及免疫功能低下患者的多种感染。III型分泌系统（type III secretion system, T3SS）是该菌在急性感染中最重要的毒力决定因子。T3SS全部基因的转录由主调控因子ExsA驱动，ExsA可结合靶启动子并招募RNA聚合酶，从而激活T3SS表达。鉴于T3SS表达具有较高的能量代价，其调控网络精细复杂。此前已发现ExsD和PtrA能够直接结合ExsA并抑制其活性，但其他以ExsA为靶点的负调控蛋白仍不清楚。为了揭示新的T3SS调控机制，研究人员系统开展了ExsA相互作用蛋白的鉴定与功能研究，最终发现酪氨酸磷蛋白A（tyrosine phosphoprotein A, TypA）能够与ExsA直接互作并抑制T3SS表达，成果发表于《Microorganisms》。
研究人员主要使用了以下关键技术方法：以铜绿假单胞菌PAK、PAO1和PA14菌株及相应typA缺失/回补菌株为材料，使用A549上皮细胞和雌性BALB/c小鼠开展感染实验；通过免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱鉴定ExsA结合蛋白；利用细菌双杂交和GST pull-down验证蛋白间直接互作；采用凝胶迁移率变动实验（EMSA）检测TypA对ExsA启动子结合能力的影响；结合Western blot、启动子-lacZ转录融合及实时荧光定量PCR分析T3SS表达水平；通过结晶紫染色评价细菌对宿主细胞的毒性，并以小鼠急性肺炎模型评价体内毒力；同时开展低温生长实验检测TypA在冷适应中的作用。
3.1 鉴定与主激活因子ExsA相互作用的候选蛋白
研究人员在exsA缺失的PAK菌株中表达ExsA-Flag-His融合蛋白，通过Co-IP联合质谱鉴定到417个候选互作蛋白，其中包含已知的ExsA结合蛋白ExsD，还检测到分子量约66.9 kD的TypA。后续在染色体内整合typA-Flag的菌株中过表达ExsA-His，可特异共沉淀TypA-Flag；细菌双杂交显示TypA与ExsA共表达时β-半乳糖苷酶活性明显升高，且高于阳性对照ExsA-ExsD；GST pull-down也证实GST-ExsA-His可捕获TypA-Flag-His。上述结果确认TypA是ExsA的直接相互作用蛋白。
3.2 TypA阻止ExsA与P
exsC启动子结合
EMSA结果显示，ExsA-His可与exsC启动子片段形成迁移条带，而阴性对照algD片段无此现象。加入TypA蛋白后，ExsA与P
exsC的结合明显减弱，且抑制效果随TypA剂量增加而增强，而对照蛋白GST无此作用。这说明TypA通过与ExsA直接结合，阻断ExsA对T3SS启动子的识别与结合。
3.3 typA缺失增强铜绿假单胞菌T3SS表达
在PAK中敲除typA后，T3SS诱导条件（5 mM EGTA）下ExoS的表达和分泌均升高，回补typA可恢复。P
exsC-lacZ转录融合报告基因活性在ΔtypA菌株中显著增强，实时qPCR也显示exsC、exsA和exoS的mRNA水平升高。同时，ΔtypA菌株对A549细胞的毒性增强，typA过表达则降低ExoS水平与细胞毒性。小鼠急性肺炎模型中，typA突变株在肺组织中的细菌载量高于野生型。在PAO1和PA14菌株背景中，typA缺失同样导致ExoS或ExoU表达/分泌增加及细胞毒性升高，表明TypA抑制T3SS不是菌株特异性现象。
3.4 typA表达模式
实时qPCR检测显示，加入5 mM EGTA或与A549宿主细胞接触后，typA mRNA水平显著上调；培养温度由37 ℃降至20 ℃时，typA表达升高约3.21倍，与冷休克响应基因capB的变化趋势相似。在生物被膜生活方式下，typA表达较浮游状态上调，而exsA、exsC和exoS的表达下降。这些结果说明typA可被低钙、宿主接触、低温和生物被膜生活方式诱导表达。
3.5 typA突变损害铜绿假单胞菌低温生长
将梯度稀释的菌液点种于LB琼脂平板后，37 ℃培养时typA突变株与野生型PAK生长无明显差异；但在20 ℃培养时，typA突变株生长出现明显缺陷，回补typA可恢复其生长能力，表明TypA在铜绿假单胞菌的冷适应中具有重要作用。
讨论指出，TypA又称BipA，属于EF-G家族翻译GTP酶，最初被鉴定为对杀菌/通透性增加蛋白（BPI）响应的蛋白。已有报道TypA参与低温条件下核糖体组装及多种病原菌的毒力调控。本研究确认TypA是铜绿假单胞菌T3SS的负调控因子，但其酪氨酸磷酸化是否影响该功能，以及TypA对T3SS的抑制是否依赖其GTP酶活性，仍需后续研究。此外，以往在PA14与盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）互作条件下发现typA突变下调T3SS基因表达，而本研究在5 mM EGTA等传统T3SS诱导条件下观察到typA缺失增强T3SS表达；这种差异可能源于实验条件或菌株传代差异。质谱结果还提示MgtE、RsmA等已知T3SS调控因子也可能与ExsA互作，尚待进一步验证；TypA究竟是阻断ExsA同源二聚化还是直接遮蔽其DNA结合结构域，也需要结构生物学和生化实验加以区分。
总而言之，研究人员将TypA鉴定为一种此前未被表征的ExsA结合蛋白，并阐明其通过调节ExsA的DNA结合能力抑制铜绿假单胞菌T3SS的机制。研究还揭示typA转录受低温、低钙、宿主细胞接触及生物被膜生长状态诱导。该研究的重要性在于发现了一个新型T3SS负调控因子并阐明其调控回路，深化了对铜绿假单胞菌毒力调控机制的理解。
