口腔生物膜介导的医用不锈钢腐蚀与群落相互作用及胞外核黄素相关

《Microorganisms》：Community Interactions and Extracellular Riboflavin Are Associated with Oral Biofilm-Mediated Medical Stainless Steel Corrosion

　　

微生物影响腐蚀（MIC）在口腔生物材料界面被视为一种生态学现象，然而微生物组成和种间相互作用如何影响腐蚀仍不清楚。本研究探讨了口腔微生物群落组成和种间相互作用是否促进医用316L不锈钢腐蚀。菌群联合增强Cr和Fe释放及局部表面点蚀，且存在显著的个体间差异。界面相关生物膜表现出组成变化趋势，并富集发酵和核黄素代谢的预测通路，同时具有比浮游群落更高的基于基因组的代谢相互作用潜力。胞外核黄素在MIC系统中积累，并与溶解态Cr和Fe浓度正相关。在扰动实验中，核黄素补充增加了腐蚀电流密度（i_corr）和金属溶出，而玫瑰黄素降低了胞外核黄素可用性及腐蚀相关参数，但未显著改变所测生物膜生物量或表面相关ATP水平。一个由三株菌组成的规定菌群（C. tsuruhatensis、R. erythropolis和T. aromatica）重建了S3高腐蚀表型，包括升高的i_corr、胞外核黄素积累和诱导的点蚀，与提出的涉及物种依赖性代谢相互作用的核黄素关联模型一致。这些发现表明，胞外核黄素可能代表一种与微生物群落相互作用和腐蚀活性相关的候选氧化还原活性因子，为理解口腔生物材料界面上微生物群相关的腐蚀行为提供了生态学框架。

**口腔生物膜介导的医用不锈钢腐蚀：群落相互作用与胞外核黄素的作用机制**

**一、研究背景与研究意义**

微生物在固体表面定殖后可形成与周围流体环境显著不同的理化微环境。在多物种生物膜内，空间组织、营养交换、竞争和代谢产物滞留可调控局部pH、氧可用性、氧化还原电位及界面化学性质。因此，定殖表面所表现出的功能可能是群落组装的新兴属性，而非单一类群丰度或活性的简单可预测后果。口腔为研究这些过程提供了动态且临床相关的系统：口腔微生物在唾液流动、营养脉冲、pH变化、氧梯度及机械扰动等波动条件下定殖于牙齿、黏膜和人工材料表面，主要以结构化多物种生物膜形式存在，其中共聚集、竞争、信号传导和代谢交叉喂养可产生微尺度化学异质性。

正畸矫治器将金属表面引入这一生态系统。医用级316L不锈钢（316L SS）因其力学性能、可加工性、生物相容性和耐腐蚀性而广泛用于正畸装置及临时支抗组件。其耐腐蚀性源于富铬钝化氧化膜，但该膜可被酸性挑战、氟化物暴露、含氯唾液、蛋白质、机械载荷和磨损所破坏。生物膜定殖进一步增加了复杂性：生物膜可在金属表面富集胞外聚合物、代谢物、离子和腐蚀产物，同时建立pH、氧和氧化还原电位的局部梯度。因此，口腔环境中316L SS的腐蚀不能仅从唾液化学或材料特性推断。

微生物影响腐蚀（MIC）描述了材料界面上微生物活性改变腐蚀过程的现象。既有MIC机制包括局部酸化、氧耗竭、胞外聚合物积累、矿物沉积、钝化膜改性、金属离子络合及界面氧化还原化学变化。尽管MIC常通过单一腐蚀性微生物或微生物总体丰度来研究，但这些方法难以解释为何定殖于相似表面的不同群落可产生不同腐蚀结果。在多物种生物膜中，一个类群可通过提供代谢物、去除抑制性产物、改变局部氧或pH条件、或促进其他成员的持续存在和空间组织来间接改变腐蚀。因此，功能互补性和种间相互作用可能影响腐蚀，即使没有任何单一成员足以产生完整表型。

黄素类物质为微生物代谢与界面氧化还原过程之间提供了可行的候选联系。核黄素及相关黄素可在多种微生物中作为可扩散的氧化还原介体，在某些系统中促进向胞外底物的细胞外电子传递（EET）。核黄素相关过程也已被认为与不锈钢MIC有关。然而，多物种口腔生物膜中胞外核黄素积累的生态学基础尚不清楚。特别是，尚不清楚腐蚀活性口腔生物膜是否以独特的群落结构和代谢互补性为特征，这些特性是否与胞外核黄素积累相关，以及简化的群落是否能重现高腐蚀表型的关键特征。

针对上述问题，本研究以群落水平表型为切入点，系统探究了口腔菌群介导的医用316L SS腐蚀。该研究发表在《Microorganisms》期刊上，为理解口腔生物材料界面上微生物群相关的腐蚀行为提供了生态学框架。

**二、主要技术方法**

研究人员从中国医科大学口腔医院招募了13名成年受试者（年龄范围20–28岁，平均23.5±2.2岁；7男6女），采集正畸微种植体相关菌斑作为口腔微生物群落样本（研究方案经中国医科大学口腔医院伦理委员会批准，批准号2021-17）。实验采用改良人工唾液培养基，在37°C厌氧条件下将受试者来源菌群与316L SS试片共孵育7天。主要技术方法包括：（1）16S rRNA基因扩增子测序（Illumina MiSeq PE300平台）结合QIIME2流程和GTDB数据库进行群落组成分析；（2）PICRUSt2功能预测和基于基因组的代谢模型（CarveMe/SMETANA）评估代谢相互作用潜力（MIP）；（3）电化学测量（开路电位和动电位极化）获取腐蚀电流密度（i_corr）；（4）电感耦合等离子体质谱（ICP–MS）定量溶解态Cr和Fe；（5）高效液相色谱（HPLC）定量胞外核黄素；（6）共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行生物膜成像和点蚀分析；（7）核黄素和玫瑰黄素化学扰动实验；（8）三菌株规定群落（C. tsuruhatensis、R. erythropolis和T. aromatica）重构实验。

**三、主要研究结果**

**3.1 受试者来源口腔群落与316L SS腐蚀相关**

对一枚回收的正畸微种植体进行扫描电镜（SEM）观察，发现种植体表面存在嵌入胞外聚合物基质中的致密多物种生物膜；去除生物量和腐蚀产物后，底层金属表面可见局部腐蚀特征。13个受试者来源菌群（S1–S13）与316L SS试片共孵育后，无菌对照仅检测到痕量Cr和Fe，而所有接种群落均产生显著更高的两种金属浓度。Cr浓度从S4的约550 ng/L到S3的约1250 ng/L不等，Fe浓度从S4的约2700 ng/L到S3的约5900 ng/L不等。S3菌群表现出最高的Cr和Fe释放，S4则显示最低的金属释放表型。

**3.2 316L SS相关生物膜与浮游群落的组成差异趋势**

对13个受试者系统的浮游和表面相关生物膜组分进行16S rRNA基因测序。浮游和生物膜组分分别含有57和27个独有OTU，22个OTU为两组分共有。基于Bray–Curtis相异度的NMDS排序显示浮游与生物膜群落之间存在分离趋势，但PERMANOVA未达到统计显著（p = 0.12）。生物膜样本在排序空间中分布更为紧密，提示316L SS表面群落趋向于降低离散度。属水平分析显示，浮游群落主要由Veillonella和Haemophilus_D主导，而表面相关生物膜中Enterobacter、Rhodococcus和Comamonas的相对丰度较高。LEfSe分析鉴定出Rhodococcus erythropolis_D、Achromobacter denitrificans、Stenotrophomonas sp. 90219255、Comamonas tsuruhatensis、Pseudomonas sp. 024666525、Lachnospira hominis、Sutcliffiella halophila、Comamonas testosteroni_B和Thauera aromatica在316L SS相关生物膜中富集。值得注意的是，潜在硫酸盐还原菌Desulfobulbus oralis仅在受试者S4的浮游群落中检出（相对丰度0.12%），所有生物膜样本中均未检出。

**3.3 生物膜相关功能潜力与胞外核黄素可用性与316L SS腐蚀活性增强相关**

PICRUSt2功能预测显示，相对于浮游群落，生物膜相关群落在膜结合[NiFe]-氢化酶、丙酮酸代谢、乙酰辅酶A转化为乙酸、柠檬酸代谢和核黄素代谢相关的预测通路丰度更高。类群-功能映射表明，生物膜富集类群（包括Rhodococcus、Achromobacter、Stenotrophomonas、Pseudomonas、Lachnospira、Sutcliffiella和Thauera）与预测的发酵相关功能相关，而Comamonas与预测的核黄素生物合成能力相关。

选择S3菌群（13个受试者菌群中Cr和Fe释放最高者）进行进一步评估。S3菌群的无细胞代谢产物将i_corr从无菌对照的0.024 μA/cm2提高至0.12 μA/cm2，但远低于完整S3菌群所测的13.1 μA/cm2，表明可溶性培养代谢产物不能单独解释完整菌群诱导的严重腐蚀。

所有受试者菌群系统中均检测到胞外核黄素，无菌对照中未检出。核黄素浓度在第7天普遍高于第4天，表明其随时间积累。S3菌群在第7天表现出最高的胞外核黄素浓度之一。相关性分析显示，跨所有菌群，胞外核黄素浓度与溶解态Cr（Spearman r = 0.83，p < 0.05）和Fe（r = 0.85，p < 0.05）浓度均呈正相关。

在S3菌群系统中，核黄素补充使i_corr从13 μA/cm2增加至20 μA/cm2，而玫瑰黄素处理将i_corr降至0.2 μA/cm2。核黄素或玫瑰黄素添加对表面相关ATP水平无显著影响。在无外加有机碳源的寡营养条件下，S3菌群显著加速Cr和Fe释放，核黄素补充进一步增加两种溶解金属浓度，而玫瑰黄素处理则降低Cr和Fe释放。所有实验组的pH均保持近中性。

**3.4 核黄素关联的种间相互作用与316L SS腐蚀增强相关**

基于基因组的代谢相互作用潜力分析显示，生物膜相关群落的平均MIP显著高于浮游群落（0.82±0.01 vs. 0.56±0.05）。成对MIP分析鉴定出Comamonas与多种生物膜富集类群（包括Rhodococcus和Thauera）之间的预测代谢相互作用。基因组注释表明Comamonas含有与预测核黄素生物合成能力一致的基因，而Rhodococcus和Thauera缺乏完整的预测核黄素生物合成途径，但保留了可能与核黄素利用相关的基因。

基于生物膜富集和高预测代谢互补性，研究人员构建了由C. tsuruhatensis（Cts）、R. erythropolis（Rer）和T. aromatica（Tar）组成的三菌株规定群落。CLSM分析显示，三种单菌培养仅形成稀疏、不连续的表面聚集体，双菌组合仅显示中等表面覆盖和有限的三维成熟，而三菌联合群落形成了致密、连续的生物膜结构，与S3群落高度相似。生物膜厚度测量支持三菌联合群落的优势。

电化学评估显示，单菌培养中Cts的i_corr最高（3.8 μA/cm2），Rer和Tar显著较低。双菌群落显示中等腐蚀活性，含Cts的组合通常显示高于Cts单独或Rer+Tar组合的i_corr值。基础条件下，三菌联合群落的i_corr显著升高并接近S3观察值。核黄素补充增加i_corr，而玫瑰黄素处理相对于相应基线培养降低i_corr值。最显著的腐蚀响应出现在含Cts的群落中，这些群落与较高的胞外核黄素可用性相关。

胞外核黄素定量显示，核黄素积累主要出现在含Cts的培养中，在Cts+Rer+Tar组合中达到最高水平，与S3相当，而Rer、Tar及Rer+Tar组合中的核黄素水平极低。玫瑰黄素补充降低了含Cts系统中的胞外核黄素浓度。表面形貌分析显示，含Cts的培养诱导逐渐加深和扩展的点蚀损伤，三菌联合群落诱导最深的点蚀，与S3的腐蚀严重程度相当。核黄素补充增加Cr和Fe释放，玫瑰黄素则抑制金属溶出，但这些腐蚀变化并未伴随生物膜生物量或表面相关ATP水平的普遍增加。

**四、讨论与结论**

本研究表明，口腔菌群介导的316L SS腐蚀随群落组成而变化，且与物种依赖性代谢相互作用的假设作用一致。受试者来源口腔菌群加速了金属释放和局部表面腐蚀，群落间存在显著差异。包含C. tsuruhatensis、R. erythropolis和T. aromatica的规定重构群落重现了S3菌群的高腐蚀表型，包括升高的i_corr、胞外核黄素积累、生物膜形成和诱导点蚀。在受试者来源和重构系统中，腐蚀活性群落的胞外核黄素水平均较高，在重构群落中达到最高水平。核黄素补充增加了口腔菌群介导的316L SS腐蚀，而玫瑰黄素降低了胞外核黄素可用性并与较低的腐蚀相关测量值相关。

与通过酸性代谢产物诱导腐蚀的S. mutans途径不同，本研究中培养基的pH在7天实验中保持近中性，排除了整体酸化作为主要驱动因素。研究提出核黄素作为可扩散的氧化还原介体，在微生物细胞和钢表面之间穿梭电子，促进阴极反应和局部金属溶出。然而，研究人员未进行生物膜-金属界面电子通量和核黄素交换的直接测量，因此该机制被呈现为与现有数据一致的提议。研究还指出，硫酸盐还原菌在口腔MIC中的潜在重要性不能被低丰度或未检出所排除，未来需采用靶向功能方法（如dsrAB靶向qPCR、宏基因组或宏转录组测序）进行评估。

该研究的局限性包括：功能和代谢推断主要基于16S rRNA基因测序和预测方法而非直接测量；三菌株群落简化了多样化的口腔菌群；玫瑰黄素可能对黄素依赖性代谢产生更广泛的影响；离体实验的静态厌氧条件不能完全再现口腔环境的动态特征；动电位极化测量代表终点快照而非时间分辨监测；队列规模（13名受试者）可能无法涵盖更广泛人群的口腔菌群多样性。尽管存在这些限制，供体来源群落、界面相关分析、代谢物和电化学测定以及规定群落重构的整合，为研究作为口腔生物膜生态学新兴属性的生物材料降解提供了实验生态学框架。