俄罗斯葡萄种质资源的病毒组学：最终研究与总结

《Plants》：Virome of the Russian Grapevine Germplasm: A Final Study and Summary

　　

葡萄种质资源圃在葡萄遗传资源保存中发挥重要作用，因此需要持续开展植物检疫监测。本研究利用总RNA高通量测序技术分析了俄罗斯Magarach葡萄种质资源圃中葡萄的病毒组。共鉴定出27种葡萄病毒和4种类病毒。其中两种病毒被鉴定为推定新种：（+）ssRNA葡萄umbra样病毒5（GULV-5）和双分体（+）ssRNA葡萄Magarach secovirus（GMSV），后者可能与其相关病毒在Secoviridae科内代表一个新属。在经济重要病毒中，检出率最高的为葡萄扇叶病毒（GFLV；76%）、葡萄卷叶相关病毒1型（GLRaV-1；39%）和葡萄病毒A（GVA；33%）。在50%分析的葡萄样本中检测到涉及上述两种或三种病毒的混合侵染。葡萄病毒D（GVD）为俄罗斯首次检出。对222条组装的病毒和类病毒基因组序列的系统发育分析揭示了较高的遗传多样性。所得结果与先前对俄罗斯四个葡萄种质资源圃的病毒组研究进行了总结和比较。

**研究背景与目的**

葡萄是广泛栽培的重要经济作物，在葡萄酒、鲜食果品及加工产品中占据核心地位。近年来，气候变化加剧，极端气候事件对全球葡萄园产量和品质构成严重威胁。因此，充分利用葡萄遗传资源选育抗逆品种成为重要方向。葡萄种质资源圃是保存葡萄遗传多样性的关键设施，但病毒和类病毒等病原体可在圃内持续积累和扩散，削弱品种的农业与育种价值。此前研究人员已对俄罗斯四个种质资源圃（Anapa、Dagestan两个圃及Don圃）开展病毒组研究，发现多种经济重要病毒及七种新病毒，包括葡萄pararetrovirus（GPRV）、葡萄alphapartitivirus（GAPV）、葡萄secovirus（GSV）和四种葡萄umbra样病毒（GULV-1至GULV-4）。本研究聚焦于世界最古老、规模最大的Magarach葡萄种质资源圃，该圃保存有4120份样本，遗传多样性极高，亟需系统评估其病毒组构成与遗传变异。

**研究内容与总体结论**

研究人员对Magarach圃中51株表现病毒相关症状的葡萄样本进行了总RNA高通量测序，共鉴定出27种病毒种（含两种推定新种）和4种类病毒，属于17个属。优势病毒为葡萄rupestris茎痘伴随病毒（GRSPaV；96%）、葡萄扇叶病毒（GFLV；76%）、葡萄Pinot gris病毒（GPGV；71%）和啤酒花矮化类病毒（HSVd；98%）。经济重要病毒中，GFLV（76%）、GLRaV-1（39%）和GVA（33%）检出率最高。葡萄病毒D（GVD）在俄罗斯首次检出。两种推定新病毒——葡萄umbra样病毒5（GULV-5）和葡萄Magarach secovirus（GMSV）——的基因组结构、系统发育位置及物种界定标准均被详细刻画。结合此前的四项研究，俄罗斯五个主要种质资源圃的病毒组调查现已完成，共分析222株葡萄，鉴定出31种病毒和4种类病毒，并组装了776条完整或近完整病毒基因组序列。

**主要技术方法**

供试样本来自Magarach葡萄种质资源圃，2020年采集51份具病毒相关症状的混合茎叶组织。总RNA经CTAB-LiCl法提取，去除DNA和核糖体RNA后构建cDNA文库，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序。原始读段经质控后用SPAdes和Geneious进行de novo组装，通过TblastX等比对工具注释病毒序列。所有病毒和类病毒的检出均由RT-PCR或RT-qPCR验证。推定新病毒利用ORFfinder和InterPro预测开放阅读框及保守结构域，采用最大似然法构建系统发育树，并通过SDT计算序列一致性以判定物种归属。

**研究结果**

**2.1 RNA测序数据分析**

51个文库共生成8.21亿条原始读段，每个文库平均平均1790万条。去除低质量和重复序列后剩余1.06亿条读段，供后续组装使用。Geneious组装平均产生72603个contigs（N50=726 bp），SPAdes平均产生4639个contigs（N50=1379 bp）。

**2.2 已知葡萄病毒和类病毒的鉴定与遗传多样性**

检出27种病毒和4种类病毒，归入17个属。混合感染常见，50个样本同时携带2至17种病毒或类病毒。对201条病毒基因组和11条GFkV外壳蛋白基因序列的系统发育分析显示较高遗传多样性。GFLV的RNA₁和RNA₂均形成两个大分支，一分支主要为俄罗斯（达吉斯坦和Magarach）分离株，另一分支包含欧洲、非洲和北美分离株，部分亚洲分离株与俄罗斯分支聚类，提示全球GFLV种群分为亚洲和欧洲相关组。GLRaV-2分离株归属PN、H4和PV20系统群；GLRaV-3分离株属于系统群I和II，其中一个分离株与GLRaV-3m菌株接近。GPGV分离株与欧洲株系接近且缺乏强毒相关的MP/CP早期终止密码子。GRSPaV分离株覆盖已知6个系统群中的5个（1、2a、2b、2c、3），未检出系统群4。此外，GLRaV-4 Ob株系和GLRaV-7在俄罗斯亦被检出。

**2.3 新病毒的发现与特征**

GULV-5：从C1956文库组装出接近完整的3586 bp病毒基因组，与已报道的GULV-4核苷酸一致性为69.5%，低于Umbravirus属70%的种界定阈值。其基因组含4个ORF，ORF1和ORF2通过?1核糖体移码翻译复制酶，ORF3和ORF4编码功能未知蛋白。系统发育分析将GULV-2、GULV-3、GULV-4和GULV-5聚类为一个独立分支，支持GULV-5代表一个推定新种。RT-PCR在7个样本中验证到该病毒。

GMSV：从C1963文库组装出两个基因组片段，分别长5968 nt和2926 nt，与Fabavirus属成员关系最近。RNA₁编码含解旋酶、蛋白酶和聚合酶结构域的多聚蛋白1，RNA₂编码含外壳蛋白结构域的多聚蛋白2。Pro-Pol和CP区的氨基酸一致性分析显示，GMSV与已知相关病毒的同一性仅为36.2%–66.0%和8.1%–32.0%，明显低于Secoviridae科约80%和75%的种界定阈值，因而被认定为推定新种。此外，C1960文库中组装的GSV-1960分离株与已报道的GSV和葡萄fabavirus 2在Pro-Pol区共享92.5%–97.9%氨基酸一致性，归入同一病毒种。系统发育树表明GMSV、GSV、GFabV2、yucca gloriosa secovirus（YgSV）、樟树fabavirus（CtFabV）和琵琶柴fabavirus（RsFabV）共同形成一个介于Comovirus和Fabavirus之间的独立分支，可能代表Secoviridae科中的一个新属。

**总结与讨论**

本系列研究完成了俄罗斯五个主要葡萄种质资源圃的病毒组调查。共分析222株葡萄，鉴定31种病毒和4种类病毒，六种病毒和两种类病毒在所有圃中均有检出，其中GRSPaV（95%）和GPGV（79%）最为普遍。经济重要病害中，GFLV检出率最高（42%），其次为GLRaV-1（16%）和GLRaV-3（13%）。研究新发现了十种此前未在俄罗斯报道的病毒和九个新病毒种，GPRV检出率最高（32%），GULV-1检出率为12%。基因组资源扩充了全球葡萄病毒流行病学和群体遗传学研究的基础。系统发育分析揭示了GFLV的地理分化和GPGV可能经欧洲种植材料引入的传播路径，并证实俄罗斯不存在强毒GPGV株系。GLRaV-3仅覆盖全球已知9个系统群中的2个，提示仍应严格管控进口苗木的植物检疫。GVA和GLRaV-2的系统群组成同样与致病性差异相关。

**结论**

种质资源圃是已知和未描述葡萄病毒及类病毒的重要储库，本研究证实俄罗斯葡萄种质中病毒组多样性极高，包含经济重要病毒、遗传多样的分子变异及推定新种。系统检疫监测和卫生防控措施对保护葡萄种质资源健康不可或缺。基于高通量测序的病毒组分析可高效实现病毒诊断、多样性评估和潜伏新病原的发现，应作为进入种质圃前初步检测和必要时开展病毒消除的有力工具。