大豆GH5基因家族的全基因组鉴定及GmGH5-22在耐盐性中的功能分析

《Plants》：Genome-Wide Identification of the Soybean GH5 Gene Family and Functional Analysis of GmGH5-22 in Salt Tolerance

　　

植物GH5家族基因在细胞壁生物合成和胁迫响应中均发挥作用。然而，目前对大豆中GH5基因的综合研究仍然有限。本研究从大豆基因组中鉴定出28个GmGH5基因。系统发育分析将这些基因划分为三个亚家族（I–III），在亚家族IV中没有代表成员。GmGH5家族含有15个保守基序，这些基序在亚家族内基本相似，但在不同亚家族间存在差异。此外，外显子-内含子结构（2–7个内含子）表现出进化枝特异性模式，同一进化枝内的成员具有相似的内含子数量和长度，而不同进化枝则显示出一些差异。GmGH5基因的启动子区域含有多种与胁迫响应和发育过程相关的顺式作用调控元件。基于转录组的表达谱揭示了GmGH5基因具有显著的组织特异性表达模式。RT-qPCR进一步确认了它们在盐、碱、冷和干旱胁迫下的差异表达，尤其值得注意的是，GmGH5-22在盐胁迫下表达显著升高（6小时时约22倍，**** p < 0.0001）。此外，GmGH5-22在根中高表达，在本氏烟草叶片中的瞬时表达显示其定位于细胞外周，这与其预测的胞外定位一致，表明GmGH5-22极有可能定位于细胞壁。在大豆毛状根中过表达GmGH5-22显著提高了对盐胁迫的耐受性。这些发现为GmGH5基因的功能鉴定奠定了基础，并为提高大豆耐盐性的分子育种提供了可行靶点。

土壤盐渍化是威胁全球农业可持续性和粮食安全的主要非生物胁迫因素。根据联合国粮食及农业组织（FAO）2024年发布的全球评估报告，全球约13.8亿公顷土地（约占全球总土地面积的10.7%）受到盐渍化影响，另有10亿公顷土地面临气候变化和不合理人为管理带来的风险。盐渍化已影响全球约20%的灌溉农田，在严重地区，水稻和豆类等敏感作物的产量损失可高达70%。大豆（Glycine max (L.) Merr）是全球重要的植物油和蛋白质来源，但土壤盐渍化严重制约其生产。盐胁迫会引发渗透失衡、过量Na⁺积累导致的离子毒性和活性氧（ROS）爆发引起的氧化损伤等一系列生理紊乱，抑制营养生长和生殖发育，最终导致产量大幅下降。植物细胞壁作为感知环境信号的第一道屏障，在逆境条件下会发生组成和结构的动态重塑以维持细胞完整性。糖苷水解酶（GHs）是细胞壁动态重塑的关键调控因子，其中糖苷水解酶家族5（GH5）是功能最多样化的家族之一，包含具有保守（β/α）₈桶状催化结构域的酶，具有β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等活性。GH5酶水解细胞壁多糖中的糖苷键，释放的寡糖片段可作为损伤相关分子模式（DAMPs）激活胁迫信号。在盐胁迫下，这种水解通过松弛细胞壁结构维持根系生长促进细胞壁重塑，同时释放可溶性糖参与渗透调节并增强抗氧化防御。尽管GH5家族在植物生长和逆境响应中的重要性已被认识，但其在大豆中的功能角色，尤其是盐胁迫下的作用，仍然 largely elusive。因此，研究人员开展了大豆GH5基因家族的全基因组鉴定及GmGH5-22耐盐功能分析。

研究人员利用HMMER3.0基于GH5家族隐马尔可夫模型（Pfam PF00150）搜索大豆蛋白质组，鉴定出28个非冗余GmGH5基因。使用SMART和CDD验证GH5催化结构域。利用SignalP-5.0、TMHMM-2.0、Plant-mPloc等工具预测信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位。通过Phytozome数据库获取大豆（Wm82.a4.v1）、水稻（MSU v7.0）和拟南芥（TAIR10）的GH5蛋白序列，采用邻接法（NJ）构建系统发育树。使用MCScanX进行共线性分析，利用PlantCARE预测启动子顺式作用元件。利用SoyOmics数据库（CRA008947）分析组织特异性表达，该数据集包含多个大豆种质。以大豆品种DN50为材料，在V2期进行盐（200 mM NaCl）、碱（50 mM NaHCO₃）、干旱（20% PEG 6000）和冷（4 °C）胁迫处理，通过RT-qPCR检测基因表达。构建GmGH5-22-GFP融合表达载体，在本氏烟草叶片中瞬时表达，通过共聚焦显微镜观察亚细胞定位。构建pCAMBIA3301-GmGH5-22-3Flag过表达载体，通过发根农杆菌K599介导转化大豆毛状根，对毛状根复合植株进行100 mM NaCl处理，检测表型、DAB/NBT染色、SOD/POD活性、相对含水量（RWC）和Na⁺/K⁺含量。

2.1 大豆中GmGH5家族的鉴定：通过HMMER3.0系统全基因组分析，在大豆基因组中鉴定出28个非冗余GH5基因，命名为GmGH5-1至GmGH5-28。其CDS长度为1209-1728 bp，蛋白长度为402-575个氨基酸，分子量为46.058-63.148 kDa，等电点范围5.24-9.54。其中20个（71.4%）等电点低于7，表明多数成员富含酸性氨基酸。23个成员具有N端信号肽，5个成员（GmGH5-6/9/19/20/23）缺乏信号肽但含有跨膜结构域（9-35 aa）。GmGH5-12和GmGH5-17含有RICIN（R型凝集素）结构域。亚细胞定位预测显示16个定位于细胞质（14个仅细胞质，2个具有额外定位），10个定位于细胞壁（6个仅细胞壁，4个具有额外定位），2个仅定位于细胞核。

2.2 GmGH5基因的染色体定位和系统发育分析：28个基因分布在13条染色体上（Chr 01, 03, 05, 06, 08, 09, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19），8号染色体最多（4个成员）。系统发育分析将60个GH5蛋白（大豆28个、拟南芥12个、水稻20个）分为4个亚家族（I-IV），大豆成员分布于I-III亚家族，IV亚家族无大豆成员。I亚家族包含16个大豆成员（57.1%），II有7个，III有5个。拟南芥仅含有I和II亚家族成员。这些结果表明四组拓扑结构先于单子叶-双子叶分化，IV组在单子叶中保留但在双子叶中丢失，III组在拟南芥中也缺失，I组在大豆中的扩张暗示双子叶特异的功能分化。

2.3 GmGH5基因家族的共线性分析：共鉴定出24对片段化复制基因对，分布于13条染色体上，表明片段化复制而非染色体内事件是家族扩张的主要驱动力。例如GmGH5-1（Chr 01）与GmGH5-16（Chr 11）之间、GmGH5-2（Chr 03）与GmGH5-27（Chr 18）之间存在稳健的复制对，还鉴定出连接多个基因的模块，支持全基因组复制（WGD）事件后复制基因的保留。

2.4 基因结构和蛋白基序分析：所有成员都含有完整的GH5催化结构域。MEME分析预测出15个保守基序（Motif 1-15），同一进化枝内基序组成相似，不同亚进化枝间差异明显。内含子数量为2-7个，同一亚家族内含子结构相似，不同亚家族差异显著。基因结构、基序组成和结构域分布的差异暗示GmGH5家族在进化过程中发生功能分化。

2.5 顺式作用元件分析：启动子区域含有三类主要顺式作用元件：胁迫响应元件（377个拷贝）最丰富，其次是植物生长相关元件（301个）和植物激素响应元件（246个）。胁迫响应元件中MYB、MYC和厌氧响应元件（AREs）富集最显著。激素调控方面，多数启动子含有ABRE、ERE和CGTCA-motif。所有基因都含有生长发育相关的Box4元件。

2.6 不同发育阶段的时空表达模式：利用SoyOmics数据库分析27个组织/发育阶段的表达谱，显示高度组织特异性表达。GmGH5-22在幼苗期根中优先富集，GmGH5-8在茎和子叶中高表达，GmGH5-10在三叶期茎中上调，GmGH5-1/16/19在五叶期叶片中富集，GmGH5-3在花期被诱导，随后在荚和早期种子中表达，GmGH5-22在生殖后期荚（pod-3）中瞬时高表达。

2.7 非生物胁迫下的表达模式：RT-qPCR显示，盐胁迫下GmGH5-7、GmGH5-21和GmGH5-22上调，其中GmGH5-22增加最显著；碱胁迫下除GmGH5-8外大多数基因上调，GmGH5-21和GmGH5-22增幅最大；冷胁迫下GmGH5-7和GmGH5-8上调，而GmGH5-21和GmGH5-22下调；干旱胁迫下GmGH5-5、GmGH5-7、GmGH5-21和GmGH5-25上调，GmGH5-22显著下调。表明GmGH5s特别是GmGH5-22可能参与盐和碱胁迫响应。

2.8 GmGH5-22的亚细胞定位：SignalP 6.0、DeepLoc、CELLO和Novopro均预测GmGH5-22具有N端信号肽并定位于胞外。烟草叶片瞬时表达GmGH5-22-GFP显示荧光主要定位于细胞外周，证实其极可能为细胞壁/胞外蛋白。

2.9 GmGH5-22正向调控盐胁迫耐受性：在100 mM NaCl处理7天后，GmGH5-22-3Flag复合植株的叶片萎蔫和黄化程度显著轻于EV-3Flag。DAB和NBT染色显示GmGH5-22-3Flag叶片中H₂O₂和O₂^?积累较低，SOD和POD活性显著更高，叶片相对含水量（RWC）显著增加，根中Na⁺积累更少而K⁺水平更高，Na⁺/K⁺比值显著降低。

讨论部分总结：该研究比较了大豆、水稻和拟南芥中GH5家族，大豆含28个GH5基因，多于水稻（17个）和拟南芥（8个），表明大豆古多倍体基因组中发生了显著的谱系特异性扩张。四组拓扑结构在水稻中完整保留，而拟南芥缺乏III和IV组，大豆缺乏IV组，表明四组结构先于单子叶-双子叶分化，随后在双子叶植物中独立丢失。I组在大豆中显著扩张（16/28），可能暗示双子叶特异的功能分化。28个GmGH5蛋白在蛋白长度、结构域架构和理化性质上表现出显著多样性，23个成员具有N端信号肽，其余5个具有跨膜结构域，表明多数成员通过分泌途径靶向。两个成员含有RICIN结构域，可能参与碳水化合物识别。亚细胞定位预测显示成员主要分布于细胞质（16个）和细胞壁（10个），少数定位于细胞核，部分成员具有双重或三重定位。基因结构和保守基序分析支持系统发育分组。共线性分析鉴定出24对片段化复制基因对，表明片段化复制是家族扩张的主要驱动力。启动子含有多种胁迫响应、激素信号和发育相关顺式元件，表明GmGH5基因可能作为整合环境信号和发育程序的调控枢纽。组织特异性表达和胁迫诱导表达谱表明功能多样化。GmGH5-22因在盐和碱胁迫下持续上调及根偏好表达被选为功能表征对象。过表达GmGH5-22显著提高耐盐性，表现为ROS积累减少、抗氧化酶活性升高、水分状态改善、Na⁺/K⁺比值降低。作为推定的糖苷水解酶，GmGH5-22可能参与细胞壁重塑，释放的寡糖可能被膜上受体识别为DAMPs，激活下游防御信号包括上调抗氧化系统，这与水稻GH5BG和拟南芥中MirMAN的研究一致。但该研究使用瞬时毛状根转化系统，观察到的表型有待稳定转基因系验证，DAMP介导的信号机制仍属推测，需进一步研究。

研究结论部分翻译：本研究通过全基因组分析鉴定出大豆中28个GmGH5家族基因，系统发育分析将它们分为三个亚家族。外显子-内含子组织、保守结构域和基序、基因复制事件和蛋白质序列同一性分析表明GmGH5家族在大豆中保持保守。表达分析揭示了GmGH5s，特别是GmGH5-22可能参与大豆对盐胁迫的响应。GmGH5-22在根中高表达，极可能定位于细胞壁/胞外空间。在大豆毛状根中过表达GmGH5-22增强了对盐胁迫的耐受性。这些发现为阐明GmGH5s尤其是GmGH5-22在盐胁迫响应中的作用和调控机制奠定了基础。