海岸松中NRT3转运调控因子的扩增及其硝酸盐响应表达

《Plants》：Expansion and Nitrate-Responsive Expression of NRT3 Transport Regulators in Maritime Pine

　　

植物对硝酸盐的吸收由协调的转运系统介导，包括NPF（硝酸盐转运蛋白家族1/多肽转运蛋白家族）、NRT2（硝酸盐转运蛋白家族2）和NRT3（硝酸盐转运蛋白家族3）蛋白。虽然这些家族已在被子植物中被广泛研究，但其在针叶树中的进化与调控仍未被充分理解。在本研究中，研究人员检测了海岸松（Pinus pinaster）及代表性植物谱系中的NRT3家族。基于核苷酸序列和NRT3蛋白的系统发育分析揭示了裸子植物尤其是针叶树中该家族的广泛扩增，而被子植物中的拷贝数增加则更具谱系特异性。此外，研究人员评估了暴露于低浓度和高浓度硝酸盐的P. pinaster幼苗子叶、下胚轴和根中硝酸盐转运蛋白基因的表达情况。多个NRT3基因，尤其是PpNRT3.1、PpNRT3.3和PpNRT3.5，被硝酸盐显著诱导，而大多数NPF和NRT2基因表现出较弱或不显著的转录响应。相关性分析揭示了NRT3、NRT2和NPF转运蛋白之间不同的表达关联，包括PpNRT3.4与PpNRT2.1之间的特异性关联，以及其他NRT3旁系同源基因与NPF基因之间的更广泛相关性。这些结果表明，针叶树中NRT3的扩增伴随着旁系同源基因间的转录分化，并为未来功能研究确定了潜在的调控关系。

**海岸松（Pinus pinaster）NRT3转运调控因子扩增与硝酸盐响应表达研究解读**

## 一、研究背景

硝酸盐既是植物重要的氮源，也是调控植物代谢与发育的信号分子。植物对硝酸盐的吸收与转运由三大转运蛋白家族介导：NPF（硝酸盐转运蛋白家族1/多肽转运蛋白家族）、NRT2（硝酸盐转运蛋白家族2）和NRT3（硝酸盐转运蛋白家族3）。其中NRT3家族尤为特殊，其编码蛋白作为辅助蛋白调控NRT2的高亲和力转运活性，与NRT2共表达可显著增强后者的转运能力。尽管针叶树传统上被认为偏好利用铵态氮，但近期证据表明海岸松能高效获取和同化硝酸盐。Castro-Rodríguez等（2017）发现海岸松中NRT3家族出现异常扩增，拥有5–6个成员，而被子植物通常仅有1–2个，由此提出NRT3扩增可能伴随功能分化的假说，但各旁系同源基因的具体功能尚不明确。本研究旨在通过系统发育分析与硝酸盐响应表达谱分析，揭示NRT3家族在针叶树中的进化格局与调控分化机制，论文发表在《Plants》。

## 二、研究内容与主要结论

研究人员以海岸松及多个代表性植物谱系为对象，构建了包含72条NRT3蛋白和核苷酸序列的数据集，开展贝叶斯系统发育分析。结果显示，NRT3家族在裸子植物尤其是针叶树中普遍扩增，多数物种拥有最多5个成员，而被子植物通常仅含2个成员，其拷贝数增加（如罂粟（Papaver somniferum）、独叶草（Tetracentron sinense））呈谱系特异性。序列重新审查发现，原PpNRT3.5最可能是PpNRT3.4的等位变异体：二者均编码215个氨基酸，序列一致性高达96.7%，仅7个位点存在差异，基因组中仅检测到单一PpNRT3.4样位点，cDNA中也仅能克隆到PpNRT3.4，因此原PpNRT3.6被更名为PpNRT3.5。在表达分析中，研究人员用0.1或10 mM KNO₃处理海岸松幼苗，于2 h和24 h分别采集子叶、下胚轴和根进行RT-qPCR检测。硝酸还原酶（PpNR）和亚硝酸还原酶（PpNiR）基因的强烈诱导证实了处理体系的有效性。8个转运蛋白基因（PpNRT3.1、PpNRT3.3、PpNRT3.5、PpNPF1.1、PpNPF6.1、PpNPF6.3、PpNPF5.13和PpNPF8.1）表现出显著上调，主要在10 mM硝酸盐处理下；5个NRT3成员中有3个被显著诱导，而PpNRT2.1和PpNRT2.2均无显著转录响应。多数NPF基因响应较弱或不显著，少数成员如PpNPF6.2、PpNPF5.11和PpNPF8.3出现显著下调。相关性分析揭示了NRT3旁系同源基因间的差异共表达模式：PpNRT3.4与PpNRT2.1特异性正相关，构成典型NRT2–NRT3表达模块；PpNRT3.1、PpNRT3.3和PpNRT3.5与PpNR、PpNiR正相关；PpNRT3.2与多个NPF亚家族成员广泛关联；PpNPF7.8除PpNRT3.4外与所有NRT3成员均呈正相关。

## 三、主要关键技术方法

研究人员主要运用了以下技术：①基于Phytozome和GenBank数据库检索获得72条NRT3序列，经MUSCLE比对后，用BEAST2分别以WAG+Γ和GTR+Γ模型进行贝叶斯系统发育分析；②海岸松种子采自西班牙Albacete的"Sierra Segura y Alcaraz"地区（EAN/055/10），以0.1或10 mM KNO₃处理幼苗并于2 h和24 h取样；③RT-qPCR检测基因表达，以saposin样天冬氨酰蛋白酶和RNA结合蛋白为内参，计算Pearson相关系数构建共表达网络。

## 四、研究结果

**2.1 系统发育分析**：通过贝叶斯系统发育分析确认NRT3家族在针叶树中普遍扩增，裸子植物多数物种含5个NRT3成员，并修正了PpNRT3.5的命名。

**2.2 基因表达分析**：鉴定出8个硝酸盐显著诱导的转运蛋白基因，其中3个为NRT3家族成员，多数NPF和NRT2基因转录响应较弱或不显著。

**2.3 NRT3旁系同源基因的差异共表达模式**：PpNRT3.4与PpNRT2.1特异性正相关，其他NRT3成员与硝酸盐同化基因及NPF基因呈现不同关联模式。

## 五、讨论与结论

讨论部分指出，针叶树中NRT3的扩增可能发生在裸子植物共同祖先中，与种子植物基部的古老全基因组复制事件一致；而NRT2家族未发生类似扩增，这反映了针叶树与被子植物在氮素利用生态策略上的差异。Ortigosa等（2020）报道海岸松硝酸盐吸收在施用后约15分钟达峰，可解释多数NRT2和NPF基因在2 h时转录响应有限的现象，即转运蛋白的表达变化可能早于第一个取样时间点或受翻译后水平调控。PpNRT3.4与PpNRT2.1的特异性关联提示二者编码蛋白可能发生直接互作，类似于拟南芥AtNRT2.1与AtNAR2.1的互作模式。其他NRT3成员与NPF基因的广泛相关性则暗示针叶树NRT3蛋白可能具有超越NRT2调控的其他功能，但该假说仍需功能实验验证，且相关分析属于相关而非因果证据，应视作产生假说的工具。研究结论表明：NRT3家族在针叶树中经历了进化扩增；海岸松中多个NRT3基因对硝酸盐供应表现出显著转录响应；不同旁系同源基因与NRT2、NPF及硝酸盐同化基因间的差异表达关联支持NRT3扩增伴随调控分化的假说。这些结果为进一步实验评估各NRT3旁系同源基因在针叶树硝酸盐营养中的具体功能奠定了基础。