《mAbs》：Generation of a highly versatile TCR bispecific scaffold optimized for targeting tumor-specific peptide-HLA antigens
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将T淋巴细胞重定向至癌细胞是过去几年肿瘤学领域最有前景的治疗概念之一，并已推动多种疗法获得监管批准，涵盖过继性细胞治疗（ACT）和T细胞衔接双特异性（TEB）分子。然而，相关进展主要集中于血液系统适应症，靶向所谓的谱系抗原（如CD19、CD20、BCMA）
将T淋巴细胞重定向至癌细胞是过去几年肿瘤学领域最有前景的治疗概念之一，并已推动多种疗法获得监管批准，涵盖过继性细胞治疗（ACT）和T细胞衔接双特异性（TEB）分子。然而，相关进展主要集中于血液系统适应症，靶向所谓的谱系抗原（如CD19、CD20、BCMA）。靶向肽-HLA抗原（pHLA）已被提出作为克服实体瘤缺乏合适表面抗原这一困境的策略，但特异性识别这类低拷贝数且高度混杂的抗原所面临的技术障碍，迄今仍限制了其在更广泛患者群体中的应用。研究人员在此描述了TCER（T细胞衔接受体）的成功开发——这是一类新型且高度通用的基于T细胞受体（TCR）的TEB分子，具备经过优化的体内疗效、耐受性、血浆半衰期及稳定性特征，可广泛用于肿瘤学及其他领域靶向pHLA。
## 论文解读
### 一、研究背景与问题
过去数年间，免疫肿瘤学已成为癌症治疗的重要范式，其中检查点抑制剂（CPI）引领了这一发展。尽管CPI可在应答患者中重新激活预先存在的肿瘤特异性T细胞，但许多癌症适应症突变负荷较低，通常对CPI治疗无应答。将免疫细胞特异性重定向至恶性细胞表面抗原已成为既定治疗选择，其中过继性T细胞疗法（ACT）和T细胞衔接双特异性（TEB）抗体是最有前景的方法。针对血液系统恶性肿瘤，靶向细胞表面抗原（如CD19、CD20、BCMA）的TEB已获批准并证实有效。然而，实体瘤靶向治疗仍面临诸多挑战，包括缺乏合适的肿瘤相关抗原（TAA）、分子格式局限导致的耐受性欠佳、临床活性不足、免疫原性、生产问题及半衰期受限等。
关键问题在于，经典双特异性格式（如BiTE）依赖抗体衍生靶向结构域，仅能结合恶性细胞表面表达的抗原，而这类抗原中极少被证实具有真正的肿瘤特异性。相比之下，大多数潜在TAA来源于（非表面）胞内蛋白，包括病毒抗原、非编码区抗原、突变抗原或癌/睾丸抗原。通过靶向细胞表面以人白细胞抗原（HLA）分子呈递的肽段（即pHLA），可实现在胞内蛋白层面拓展靶点库的目标。然而，抗体（mAb）来源的pHLA结合剂用于TEB迄今未显示出显著临床结果。利用T细胞受体（TCR）衍生的靶向结构域则可生成高亲和力、高特异性的pHLA结合剂，即便pHLA在单细胞上呈递拷贝数很低也能有效靶向。tebentafusp（靶向HLA-A\*02限制性gp100肽段的TCR双特异性分子）的获批为该策略提供了概念验证，但其客观缓解率（ORR）有限，仍需进一步优化pHLA靶向TEB。
### 二、研究内容与结论
针对上述问题，研究人员以黑色素瘤优先表达抗原（PRAME）为模型靶点，基于PRAME特异性TCR衍生靶向结构域，设计了多种在靶向/招募结构域价数、分子大小、结合位点距离等方面不同的分子支架，系统评估了22种不同分子的非临床特性。研究确定了一种新型T细胞衔接受体（TCER）格式，该格式在所有测试的格式中展现出最优的综合性能。研究人员通过质谱（MS）免疫肽组学在750余份肿瘤组织和750份健康组织样本中鉴定出一个高度特异、广泛呈递的PRAME衍生HLA-A\*02:01限制性肽段，绝对定量显示肿瘤样本上呈递水平通常超过100拷贝/细胞（CpC）。TCER格式在所有不同T细胞招募抗体背景下均表现出最高的细胞毒 potency、最佳的热应激稳定性及良好的生产可开发性。功能研究表明，低亲和力的BMhanced招募抗体虽与T细胞结合极弱，却能够更强地激活NFAT信号通路、促进T细胞释放颗粒酶B、干扰素（IFN）-γ和白细胞介素（IL）-2并增强CD4+和CD8+ T细胞增殖，在小鼠异种移植肿瘤模型中实现显著更优的肿瘤控制（6只中5只达到缓解），同时在全血细胞因子释放试验中表现出明显更低的靶标非依赖性T细胞激活风险。该研究为pHLA靶向TEB的分子设计提供了重要的设计-功能关系见解，基于TCER平台的两个化合物（靶向MAGEA4/8的IMA401和靶向PRAME的IMA402）已进入临床开发阶段。论文发表在《mAbs》。
### 三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：（1）基于XCEPTOR?平台的TCR发现与亲和力成熟，采用酵母表面展示技术对单链TCR可变结构域（scTv）进行框架区和互补决定区（CDR）突变改造；（2）基于质谱（MS）的免疫肽组学（XPRESIDENT平台）用于pHLA靶点鉴定，采用AbsQuant方法（US10545154B2）进行pHLA拷贝数绝对定量；（3）生物层干涉法（BLI）用于实时结合动力学测定；（4）多种体外功能性评估方法，包括乳酸脱氢酶（LDH）释放细胞毒性试验、NFAT报告基因T细胞活性试验、Luminex多重细胞因子分泌检测及CFSE稀释法T细胞增殖试验；（5）体内药效评估采用NOG免疫缺陷小鼠Hs695T肿瘤异种移植模型联合人外周血单核细胞（PBMC）过继转移。治疗性TCR分子和BMhanced抗体经人源化改造，人源PBMCs获得自德国DRK Mannheim并获知情同意及伦理批准。体内研究由Charles River Laboratories（德国弗莱堡）开展并获RP Freiburg批准。
### 四、研究结果
**PRAME是适用于TCR疗法生成的泛癌靶点。** 通过质谱（MS）免疫肽组学分析超过750份不同病因的肿瘤组织和750份人体正常组织样本，研究人员鉴定出一个高度特异且广泛呈递的PRAME衍生HLA-A\*02:01限制性肽段（从超过40个可检测PRAME表位中选出）作为TEB疗法的优选靶点。绝对定量显示所选肿瘤适应症中PRAME pHLA典型呈递超过100拷贝/细胞（CpC），四分位距为50至300 CpC。建立RNA测序（RNAseq）与MS肽组学数据的关联分析以确定mRNA表达阈值，并应用于癌症基因组图谱（TCGA）数据库，结果显示多种实体瘤中PRAME pHLA呈普遍且高度流行的表达。
**不同TCR双特异性格式的设计与生成揭示TCER支架的优越稳定性。** 研究人员基于亲和力成熟的单链TCR可变结构域（scTv）生成并详细评估了七种不同的TCR双特异性支架，涵盖单/双价pHLA结合（1+1、2+1、2+2设计）及不同结合位点距离和是否含Fc结构域。所有分子在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时转染表达，蛋白产率2至75 mg/L，单体含量≥90%。在40°C加速应激14天后，TCER格式在所有招募抗体背景下均表现出最高应激稳定性（单体含量≥90%、高分子量物种（HMWS）<10%），而最低稳定性的87 kDa格式仅存14–17%单体且67–72%为HMWS。使用HIV特异性TCR（868Z11）的独立验证实验进一步确认TCER设计对TCR稳定性的正向影响。
**TCER格式对PRAME阳性肿瘤细胞介导最高细胞毒 potency。** 在LDH释放试验中，针对高PRAME表达的Hs695T细胞（400–550 CpC），TCER和75 kDa格式表现出最高potency；在低PRAME表达的A375细胞（约50 CpC）条件下，仅TCER格式能有效诱导靶特异性肿瘤细胞裂解，而其他六种格式均未在PRAME阴性T98G细胞背景活性之上展现A375导向的细胞毒性。对PRAME阴性T98G细胞，TCER的活性处于最低水平之一。针对scFv-scTv-Fc分子的进一步比较实验证实，TCER的优越potency与两个结合位点之间的距离短且刚性高密切相关。
**BMhanced是一种新型T细胞招募抗体，以低亲和力结合T细胞并促进超出细胞毒性以外的抗肿瘤功能。** 在取得等效应细胞毒性活性的条件下，TCER-BMhanced对CD3+ T细胞的结合极弱（仅在100 nM或以上浓度可检测），而TCER-UCHT1(V20)和TCER-SP34-similar分别表现出强和中等的T细胞结合。与结合谱相反，TCER-BMhanced在NFAT报告基因试验中诱导显著更强的T细胞激活信号，并促使T细胞分泌更高水平的颗粒酶B、IFN-γ和IL-2，同时诱导CD4+和CD8+ T细胞更强的增殖反应。
**携带BMhanced招募抗体的TCER在小鼠中表现出改善的肿瘤异种移植控制。** 在NOG小鼠Hs695T（PRAME高表达）肿瘤模型中，以0.025 mg/kg剂量每周一次共三次静脉治疗后，BMhanced-TCER治疗组6只小鼠中5只达到肿瘤缓解（含1例完全缓解），而SP34-similar和UCHT1招募抗体TCER治疗组分别仅有0/6和1/6小鼠达到缓解。
**低亲和力的BMhanced招募抗体降低TCER非特异性T细胞激活风险。** 在无靶抗原存在的人全血细胞因子释放试验中，BMhanced-TCER诱导的细胞因子释放所需浓度比SP34-similar和UCHT1分别高5倍和25倍（分别为10 μg/mL vs 2.0 μg/mL和0.4 μg/mL）。在HLA-A\*02阴性供者中，BMhanced-TCER未检测到细胞因子诱导，而高亲和力招募抗体TCER可独立于pHLA驱动机制引发全血细胞因子释放。
### 五、讨论与结论
针对不同pHLA靶点几乎具有相同三维几何特征这一特性，研究人员系统探索了TCR双特异性分子的最优支架设计。研究表明TCER的1+1设计通过缩短结合位点距离、提高TCR/效应结构域连接刚性，即使在低pHLA靶拷贝条件下也能引发充分的细胞毒性活性。低亲和力BMhanced招募抗体的优越体内活性可能得益于改善的生物分布（减少T细胞富集组织的截留并促进肿瘤部位富集）以及促进连续杀伤效应。TCER的Fc部分含有knob-into-hole突变以支持异源二聚化，效应功能沉默突变不影响新生儿Fc受体（FcRn）结合，在小鼠中呈现抗体样药代动力学特征（终末半衰期8–11天）。该研究结果为pHLA靶向双特异性分子的设计-功能关系提供了重要见解，TCER平台的两个化合物已进入临床开发阶段并在剂量爬坡I期研究中初步显示临床活性。
