黄曲霉中bZIP转录因子AflHapX协调铁稳态与黄曲霉毒素生物合成

《Mycology》：bZIP transcription factor AflHapX coordinates iron homeostasis and aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus

　　

摘要
铁稳态和次级代谢在许多真菌中由碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子HapX控制。本研究通过黄曲霉（Aspergillus flavus）基因组与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中bZIP蛋白HapX的同源性搜索及随后的基因缺失，鉴定了AflHapX。研究人员确定AflHapX是适应铁过量及铁缺乏条件的调节因子。在YES培养基上，AflhapX缺失菌株（ΔAflhapX）产生的黄曲霉毒素B₁（AFB₁）少于野生型（WT）和互补菌株（ΔAflhapXC）。尽管铁通常抑制黄曲霉中AFB₁的生物合成，但AflhapX的缺失恢复了铁对AFB₁产生的抑制作用。此外，与WT和ΔAflhapXC相比，ΔAflhapX产生更多菌核，并对氧化试剂H₂O₂、甲萘醌亚硫酸氢钠（MSB）和双酰胺表现出更高的敏感性。在花生上，ΔAflhapX菌株产生的分生孢子和AFB₁均少于WT和ΔAflhapXC。转录组分析数据为AflHapX全局调控参与黄曲霉毒素生物合成、氧化应激反应和铁稳态的基因提供了证据。研究结果表明，AflHapX可能调控铁对黄曲霉毒素产生的影响。

论文解读：黄曲霉bZIP转录因子AflHapX协调铁稳态与黄曲霉毒素生物合成的分子机制

一、研究背景与科学问题

铁是所有真核生物不可或缺的元素，参与氧运输、DNA合成和氨基酸代谢等多项生化过程。在致病真菌中，铁摄取缺陷会导致毒力下降，但过量的铁又可通过芬顿反应产生有毒的活性氧（ROS），对细胞造成损伤。因此，生物体必须通过精密调控的稳态机制来平衡铁的吸收、储存和利用。

在真菌中，铁稳态主要由两个转录因子维持：bZIP转录因子HapX（血红素激活蛋白X）和GATA型锌指转录因子SreA（铁载体转录因子A）。在铁缺乏条件下，HapX抑制SreA介导的铁利用途径，并激活铁载体生物合成以促进铁摄取；而在铁充足条件下，SreA抑制HapX表达和铁载体介导的铁获取。此外，HapX功能依赖于异源三聚体CCAAT结合复合物（CBC），两者需在DNA存在下才能形成稳定互作。值得注意的是，在铁过量条件下，HapX通过触发液泡铁转运蛋白CccA表达来解毒铁离子。除铁稳态核心功能外，HapX还参与多种生物过程。多个物种中hapX的缺失会减弱植物病原真菌和动物病原真菌的毒力，调控次级代谢产物生物合成，影响生长、产孢和微菌核形成等表型。

黄曲霉（Aspergillus flavus）是玉米和花生采后最重要的真菌病原体，产生强致癌性的黄曲霉毒素（AFs），造成严重的作物损害和经济损失。同时，黄曲霉还是侵袭性曲霉病的第二常见病原体。此前研究表明，铁条件影响真菌基因表达、黄曲霉毒素产生和真菌生长，但铁是否通过HapX调控黄曲霉毒素合成尚不清楚。近期虽报道了黄曲霉中hapX缺失导致菌核形成增加、对H₂O₂和过量铁更敏感以及AFB₁降低，但HapX在铁缺乏条件下是否发挥关键作用、是否协调铁与AFB₁的关系以及其调控机制仍然未知。基于此，本研究系统解析了AflHapX在铁稳态、黄曲霉毒素合成、氧化应激耐受、菌核形成和毒力中的功能，研究结果发表于《Mycology》。

二、主要技术方法

研究人员综合利用了多种关键技术手段开展深入研究：（1）通过同源比对搜索和系统发育分析鉴定黄曲霉中HapX同源蛋白AflHapX；（2）利用同源重组策略构建基因缺失菌株ΔAflhapX及回补菌株ΔAflhapXC；（3）通过RT-qPCR检测不同铁浓度下AflhapX的转录水平；（4）在不同铁条件下进行表型分析，包括菌落生长测定、菌核产量统计；（5）采用薄层色谱（TLC）法定量检测AFB₁产量；（6）通过外源氧化剂处理评估氧化应激敏感性；（7）利用花生侵染实验评价病原菌毒力；（8）通过RNA-seq转录组测序并结合RT-qPCR验证，解析AflHapX的全局调控网络。

三、主要研究结果

3.1 铁抑制黄曲霉中黄曲霉毒素B₁的生物合成

研究人员将等量野生型分生孢子接种于不同铁浓度的葡萄糖基本培养基（GMM）中培养7天，经TLC分析发现：与铁充足条件相比，铁缺乏条件下AFB₁产量升高，而铁过量条件下AFB₁产量降低。统计分析显示，铁过量组的AFB₁产量显著低于铁充足组，而铁缺乏组显著高于铁充足组。这些结果表明铁抑制黄曲霉中AFB₁的生物合成。

3.2 AflhapX对铁稳态至关重要

通过BLAST搜索，以烟曲霉HapX氨基酸序列为查询序列，鉴定出黄曲霉中一致率最高（76.89%）的基因AFLA_006720，其开放阅读框（ORF）全长1476 bp，无内含子，编码491个氨基酸。系统发育分析表明AFLA_006720与已表征的真菌HapX高度同源，故命名为AflhapX。结构域分析显示AflHapX含有保守的CBC结合域和bZIP结构域，并含有A、B、C、D四种类型富半胱氨酸区域。RT-qPCR显示，铁缺乏条件下AflhapX的相对表达水平显著高于铁充足条件，但铁充足与铁过量条件间无显著差异。表型分析表明，ΔAflhapX菌株在PDA培养基上无显著生长缺陷，但在GMM培养基上菌丝生长减弱。在铁缺乏和铁过量条件下，ΔAflhapX的径向生长均显著低于WT和ΔAflhapXC。特别值得注意的是，在含铁螯合剂BPS的培养基上，ΔAflhapX的气生生长被完全消除。这些结果证实AflHapX是黄曲霉铁稳态所必需的。

3.3 AflHapX偶联铁可用性与AFB₁生物合成

在YES培养基上培养7天后，ΔAflhapX菌株的AFB₁产量较WT和ΔAflhapXC显著降低。进一步在不同铁条件下检测发现，WT菌株中铁离子浓度与AFB₁产量的关系与ΔAflhapX菌株呈现相反趋势：ΔAflhapX在铁充足条件下的AFB₁产量高于铁缺乏条件，但低于铁过量条件。这些结果提示，AflHapX对AFB₁生物合成的调控是通过铁稳态途径介导的。

3.4 AflhapX缺失促进黄曲霉菌核形成

在Wickerham培养基上培养9天后，ΔAflhapX产生的菌核显著多于WT和ΔAflhapXC菌株，且ΔAflhapX产生的菌核明显更小。统计分析确认WT与AflhapX缺失菌株间的菌核产量差异显著。该发现表明AflHapX可能负向调控菌核形成。

3.5 AflhapX介导黄曲霉对氧化胁迫的响应

在含H₂O₂、双酰胺和甲萘醌亚硫酸氢钠（MSB）的YGT培养基上培养5天后，ΔAflhapX菌株对这三种氧化试剂的敏感性均高于WT和ΔAflhapXC，抑制率差异具有统计学意义。这些结果表明AflHapX可能通过铁稳态调控黄曲霉的氧化应激反应。

3.6 AflhapX缺失突变体对花生寄主的毒力受损

在花生侵染实验中，ΔAflhapX菌株在花生上的生长明显减弱，分生孢子产量和AFB₁产量均显著低于WT和ΔAflhapXC菌株，证明AflHapX是黄曲霉对花生毒力的关键调控因子。

3.7 转录组分析揭示AflHapX调控黄曲霉毒素合成、氧化应激反应和铁稳态的机制

对WT和ΔAflhapX菌株进行RNA-seq分析，共检测到10657个独特转录本，鉴定出1896个差异表达基因（DEGs），其中889个上调、1006个下调。KEGG功能分类显示DEGs归属于16个功能类别，其中代谢和遗传信息处理相关基因占比较高，表明AflHapX参与多种生物过程的调控。

在黄曲霉毒素合成方面，ΔAflhapX中毒素合成基因簇的20个基因全部下调，这些基因仅编码修饰酶。此外，包括ppoA、fadA、fluG、cpcB、veA、gprD、niaD和areA在内8个作为AFs或前体柄曲霉素（ST）全局调控因子的基因，其转录水平在WT与ΔAflhapX间存在显著差异。

在氧化应激方面，ΔAflhapX中超氧化物歧化酶基因mnSOD和双功能过氧化氢酶-过氧化物酶基因Cat2均下调，而另一个sod1基因上调。过氧化物酶体膜蛋白Pex16、过氧化物酶体膜锚定蛋白及过氧化物酶体ABC转运蛋白（PXA1）显著降低，而Pex17和过氧化物酶体生物发生因子11（Pex11）表达升高。

在铁稳态方面，五个铁消耗基因lysF、lysM、leuB、ilv3和ilvD在ΔAflhapX中上调；铁硫簇相关基因isu1和nar1表达显著降低；还原性铁同化（RIA）相关基因freA和freB表达高于WT；铁载体相关基因mirC在ΔAflhapX中上调，而另外两个铁载体相关基因表达低于WT。RT-qPCR验证结果与RNA-seq趋势一致，证实转录组数据可靠。

四、讨论与结论

本研究表明铁在GMM培养基上抑制黄曲霉AFB₁生物合成，与铁对AFB₁产生的影响可能取决于铁可用性和具体培养基成分这一推测相符。与烟曲霉、构巢曲霉、尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌等物种中HapX直系同源物功能一致，AflHapX在铁缺乏和铁过量条件下均正向调控菌丝生长。虽然过量铁未显著改变AflhapX转录水平，但ΔAflhapX在铁充足条件下径向生长显著降低。研究人员推测AflHapX可能通过泛素化水平调控黄曲霉对过量铁胁迫的响应，这在qPCR分析中无法检测。与尖孢镰刀菌和大丽轮枝菌类似，AflHapX调控lysF和ilv3等多个铁利用基因。值得注意的是，AflHapX是铁充足条件下黄曲霉毒素生物合成的正向调控因子，敲除AflhapX基因在铁过量条件下恢复了黄曲霉的AFB₁产生，进一步支持AFB₁生物合成可能通过铁稳态途径受AflHapX调控。此外，ΔAflhapX对氧化试剂敏感性增加，且氧化解毒相关基因下调，说明HapX对真菌铁依赖性氧化应激适应至关重要。综上所述，AflHapX在黄曲霉中维持铁稳态、调控黄曲霉毒素合成、应对氧化胁迫、影响菌核形成和花生毒力等方面发挥关键作用，为理解环境铁与真菌毒素产生之间的互作提供了新见解。