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选择性剪接（alternative splicing）和蛋白水解加工（proteolytic processing）通过从单个基因生成不同的蛋白质异构体（protein isoform）来扩展蛋白质组的多样性。然而，由于当前蛋白质组学工作流的局限性，转录本异构
选择性剪接（alternative splicing）和蛋白水解加工（proteolytic processing）通过从单个基因生成不同的蛋白质异构体（protein isoform）来扩展蛋白质组的多样性。然而，由于当前蛋白质组学工作流的局限性，转录本异构体（transcript isoform）与蛋白质产物之间的关系仍知之甚少。研究人员将全长mRNA测序与蛋白质分级分离及定量质谱（mass spectrometry, MS）相结合，在人类RPE-1细胞中生成了mRNA和蛋白质异构体的整合图谱。为克服自底向上蛋白质组学（bottom-up proteomics）的模糊性，研究人员开发了IsoFrac，这是一种从分子量分辨的肽段迁移谱中解析蛋白质异构体的计算流程。利用该方法，研究人员鉴定出约45,000条全长转录本、约32,000个开放阅读框（open reading frame, ORF）和约14,000个蛋白质异构体候选。比较分析显示，大多数可检测的选择性转录本均被翻译，且较短的蛋白质变体（shorter protein variant）作为蛋白质组复杂性的主要且被低估的来源，可能由蛋白水解加工和/或选择性翻译（alternative translation）产生。研究结果建立了一个可扩展的异构体分辨蛋白质基因组学（isoform-resolved proteogenomics）框架，并为研究蛋白质异构体多样性提供了资源。
研究背景与立项依据
基因表达从转录到翻译受多层次调控，选择性剪接（alternative splicing）、选择性多聚腺苷酸化、选择性翻译起始及翻译后修饰共同塑造蛋白质组多样性。长读长RNA测序已揭示转录本层面的高度异质性，但全球尺度蛋白质异构体（protein isoform，指源自选择性转录本、选择性翻译或蛋白水解切割产生的不同多肽，区别于含翻译后修饰的proteoform）的鉴定仍不完整。传统自底向上蛋白质组学（bottom-up proteomics）虽覆盖深，但因肽段在多异构体间共享而难以区分；自顶向下蛋白质组学（top-down proteomics）可直接分析完整蛋白但覆盖度有限。核心科学问题包括：多少选择性转录本被翻译为稳定蛋白？多少蛋白异构体由不依赖mRNA变异的机制（如选择性翻译起始、蛋白水解加工）产生？研究人员以人视网膜色素上皮RPE-1细胞为模型，整合全长转录组与分级分离蛋白质组学，建立mRNA-蛋白异构体匹配图谱，开发IsoFrac流程，系统回答上述问题。论文发表于《Cell Reports》。
主要关键技术方法
样本为人二倍体RPE-1细胞系。技术主线为肽段相关性分析（Peptide Correlation Profiling, PepCP）：先用GELFrEE系统按SDS-PAGE依分子量将完整蛋白分离为28个级分，经酶解、TMT标记、高pH反相分级与LC-MS/MS定量，获得肽段跨级分丰度谱；同蛋白来源的肽段在级分间丰度相关，借此从肽段数据还原蛋白层面信息。转录组侧采用PacBio长读长测序结合Illumina短读长与GENCODE v40整合，构建全长转录本与ORF注释。计算端开发IsoFrac：用HDBSCAN对肽段迹聚类、寻峰、跨凝胶合并，以梯度提升分类模型比对UniProt与PacBio ORF数据库赋值。独立验证采用Western blot与肽段水平DIA-LOP空间蛋白质组学。
研究结果
肽段相关性分析从肽段数据解析蛋白层面信息
PepCP经SDS-PAGE分级、酶解、TMT定量后，同基因内同源肽段对跨级分Pearson相关在r≈0.9处呈强峰，随机配对居中零附近，ROC AUC达0.93–0.94。无内含子基因多呈单峰；而CRK（选择性剪接）、CEBPB（选择性翻译起始）、NF-κB1（蛋白水解加工）可清晰分辨多峰，证明PepCP能区分异构体机制。
绘制蛋白质异构体图谱
IsoFrac在约8,100基因下鉴定约14,300个蛋白异构体候选，半数基因多于一个。与UniProt比对，整合IsoFrac覆盖率、UniProt覆盖率与超几何检验的回归模型AUC=0.84；Δmass分布较随机赋值更窄且富集零附近。注释类别中选择性剪接最多，其次为单条目蛋白；多UniProt异构体基因更易产多IsoFrac峰，37个无内含子基因中33个仅单峰。GO分析示正Δmass富集内质网/质膜（糖基化致表观分子量增大，LDLR双峰Western验证），负Δmass富集骨架蛋白。研究人员发布交互式IsoFrac Viewer。
长读长测序连接转录组复杂性与蛋白异构体多样性
PacBio+NGS+GENCODE整合得45,223条编码转录本、32,612个ORF（11,605基因），17%为PacBio独有。以PacBio ORF自建库赋值AUC=0.85。直接匹配率约43%，但校正SDS-PAGE不可分辨的±5 kDa同质异构体后升至51%，限TPM>3后超60%，联合校正达70%，表明多数可检测选择性剪接转录本被翻译为稳定蛋白。
大量未注释蛋白异构体为较短变体
约80% IsoFrac异构体在UniProt与PacBio赋值等效；偏好UniProt者显著富集shorter variant。Δmass分析显示，匹配UniProt不匹配PacBio者属shorter variant，多数剩余异构体两库偏移相似，提示非选择性剪接主导。TEAD3出现PacBio未覆盖的C端截短异构体（～26 kDa），密码子优化带FLAG标签构造体验证Western确认。肽段水平DIA-LOP示CTSB前体（～37 kDa，ER/高尔基体）与成熟体（～26 kDa，溶酶体）空间分离；同IsoFrac异构体肽段中心显著聚拢，随机重排则消散，佐证短变体具独立亚细胞定位。
讨论与结论翻译
尽管表征转录多样性已有大量工作，蛋白质异构体系统制图仍具挑战。本研究显示PepCP能自动化鉴定逾14,000个候选蛋白异构体，在RPE-1细胞中提供蛋白质组多样性全景。通过在酶解前分离完整蛋白，PepCP在自底向上流程中保留分子量信息。这些蛋白异构体代表源自选择性转录本、选择性翻译或蛋白水解切割的多肽，由分子量分辨肽谱与概率赋值支持。整合长读长转录组后，研究人员生成匹配mRNA-蛋白异构体图谱，指出多数可检测选择性剪接转录本被翻译，且大量未注释异构体更易由选择性翻译和/或蛋白水解加工解释。PepCP补足自底向上与自顶向下之隙：既保广泛覆盖，又嵌表观分子量。校正技术局限（分子量分辨与丰度）后，多数选择性剪接转录本产稳定蛋白。注释无关策略还暴露单条目基因多峰现象，RPE-1特异剪接仅占少数；替代翻译与蛋白水解是复杂性被低估来源。研究建立可扩展的异构体分辨蛋白质基因组学框架，并提供资源供后续生物学研究。
