《Bioengineering》：Human Muscle-Derived Cells Injected into Acute and Chronic Muscle Injuries Engraft and Support Regenerative Markers
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尿失禁（urinary incontinence, UI）即不自主的尿液泄漏，是一种常见疾病，给患者造成显著的身体、情感和经济负担。外尿道括约肌（external urethral sphincter, EUS）损伤可通过破坏负责尿液控制的骨骼肌而导致肌源性U
尿失禁（urinary incontinence, UI）即不自主的尿液泄漏，是一种常见疾病，给患者造成显著的身体、情感和经济负担。外尿道括约肌（external urethral sphincter, EUS）损伤可通过破坏负责尿液控制的骨骼肌而导致肌源性UI。本研究使用急性和慢性骨骼肌损伤模型，评估了人肌肉来源细胞（human muscle-derived cells, hMDCs）的定植与治疗潜力。免疫功能低下雌性大鼠接受心脏毒素（cardiotoxin, CTX）或体积性肌肉缺失（volumetric muscle loss, VML）损伤于胫骨前肌。研究人员于CTX损伤后1天或VML损伤后6周，分别注射100,000或500,000个第3代（passage 3）或第6代（passage 6）hMDCs进行治疗。VivoTrack成像和人白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）染色证实hMDCs在注射部位成功定植。总计500,000个第3代hMDCs降低了肌肉力量，而较晚代次（第6代）细胞对力量产生无影响。所有治疗组均出现小直径的新再生肌纤维。在慢性VML损伤中，使用500,000个第6代hMDCs的定植尽管与宿主肌纤维融合有限，仍增强了再生特征。上述发现提示，hMDCs改善了纤维化VML模型中的再生特征，但未能恢复收缩力。本研究支持hMDCs的治疗潜力，并为未来治疗尿失禁的临床策略奠定了基础。
尿失禁（UI）是患病率报道为5%–70%的常见疾病，多由外尿道括约肌（EUS）等横纹肌及其神经损伤引起；女性高发，常与分娩造成的肌纤维容积丢失和纤维化有关。现有行为训练、药物及合成吊带手术难以真正修复肌肉，且合成材料存在侵蚀、感染和慢性疼痛等风险。以自体骨骼肌来源细胞（MDC）为核心的再生医学策略具有前景，但损伤后的纤维化微环境以及细胞剂量、培养代次等因素均影响疗效。本研究旨在通过急性心脏毒素（CTX）损伤模型和慢性体积性肌肉缺失（VML）纤维化模型，评价人肌肉来源细胞（hMDCs）在骨骼肌中的定植与再生支持能力，为未来压力性尿失禁（SUI）等疾病的细胞治疗提供依据。
研究人员向CTX损伤模型大鼠注射10万或50万个第3代（p3）/第6代（p6）hMDCs，并在VML模型注射50万p6 hMDCs，结合活体成像、肌力测试、基因表达、组织学及多重免疫组化等方法进行评价。结果显示：急性损伤中高剂量hMDCs显著增强多项肌源性调节因子表达，但p3高剂量组7天肌力反而降低；慢性纤维化损伤中hMDCs可提高卫星细胞与快肌纤维再生标志物，且未加重纤维化或脂肪沉积，但未能恢复收缩力。该研究表明hMDCs具有治疗潜力，并提示剂量、代次与递送条件的精细优化至关重要。论文发表在《Bioengineering》。
关键技术方法包括：①流式细胞术检测结蛋白阳性率及体外成肌分化/融合指数分析；②建立CTX急性损伤与5 mm全层活检打孔VML慢性损伤模型，大鼠为免疫缺陷雌性RNU大鼠（Hsd: RH-Foxn1rnu，Charles River Laboratories），CTX组n=8/组，VML组按7、8、10周各n=8取材；③VivoTrack染料标记结合IVIS活体成像和HLA免疫组化验证体内定植；④Aurora 1300A系统进行在体单收缩与强直收缩肌力测试；⑤实时定量PCR检测肌源性、纤维化及黏附相关基因，以Gapdh为内参并以治疗/对照2
?ΔΔCt表示；⑥H&E切片定量最小Feret直径与中央核；⑦Opal多重免疫组化检测Pax7、MyHC-I、MyHC-II、HLA及层粘连蛋白。细胞来源：hMDCs来自Cook MyoSite（匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）人腹部活检样本，VML模型使用股外侧肌来源的p6 hMDCs。
3.1 心脏毒素损伤后的肌肉力量测试
IVIS活体成像与HLA染色证实hMDCs定位于注射部位后，CTX损伤后第7天强直收缩力以500P3组最低，其按体重标准化后显著低于对侧肢体（p=0.0081），提示高剂量p3细胞所致的广泛再生重塑使力量恢复期延长；100P3组仅表现为舒张速率增加（p=0.0127）。
3.2 心脏毒素损伤后hMDC处理的基因表达
qPCR显示，无论代次如何，50万细胞剂量均显著上调Pax7、Myf5、Myog和Myf6等早期及晚期肌源性调节因子，并增加快肌纤维标志Myh1 mRNA水平；10万细胞组变化较小。Apoe仅在500P3组升高；Pdgfrα、Ctgf、Icam1、Itgα7和Mcp1等纤维化/炎症/黏附相关基因均无明显变化，提示高剂量hMDC主要激活肌源性程序而非纤维化通路。
3.3 H&E染色组织切片的形态学分析（CTX）
H&E形态学定量显示500P3组损伤区肌纤维Feret直径最小、中央核纤维数较多，符合新生肌纤维增多特征；500P6组纤维直径分布与对侧未损伤肌接近，说明晚期代次细胞更倾向于与宿主纤维整合或促进纤维成熟。
3.4 免疫组化分析（CTX）
多重免疫组化中，p3 hMDC处理组Pax7阳性细胞数显著高于其他各组（p<0.0001），p6组亦较对侧增加（p=0.0004）；500P3组Pax7/HLA双阳性细胞显著增多（p<0.05），表明移植hMDC中确有肌干细胞样群体存在。MyHC-I与MyHC-II阳性纤维数各组间无差异；HLA阳性信号与I型肌纤维共定位而未见II型纤维共染，且500P6组HLA信号整体较弱但仍显著高于对照组。
3.5 VML后的肌肉力量测试
纵向（0、7、8、10周）肌力测试显示，PBS处理组与hMDC处理组的强直收缩力以及最大收缩/舒张速率均显著低于各自对侧未损伤肢体，但两种处理间无显著差异；第10周hMDC组仅呈轻微改善趋势而未达统计学意义，说明单独细胞注射未能恢复慢性纤维化损伤后的收缩功能。
3.6 基因表达分析：VML
肌源性标志物Pax7、Myf5、Myog、Myf6及Myh1在各处理组间无显著差异；PBS处理组第10周慢肌型肌球蛋白重链Myh7表达显著高于hMDC组（p=0.046），提示未治疗肌肉随时间出现慢肌型偏移，而细胞治疗抑制了该变化。纤维化相关基因在各组间总体相当。
3.7 组织学分析：VML
H&E定量显示，第8和10周hMDC处理组损伤侧纤维直径持续偏小且分布左移；hMDC处理组的对侧未损伤肌直径随时间增大，提示存在交叉训练样效应。第7周PBS与细胞处理组损伤区内中央核纤维均显著增多，此后细胞组仍维持一定再生特征。
3.8 免疫组化：VML
p6 hMDC处理组第7、8周Pax7阳性细胞数显著高于PBS组（p=0.0007、p=0.0085），第7周快肌MyHC-2阳性纤维比例亦升高（p=0.0205）。HLA阳性细胞在各时间点均显著高于PBS组，但阳性细胞主要位于间质而非与宿主肌纤维融合。纤维化面积与脂肪沉积比例两组间无差异，表明p6 hMDCs可改善慢性纤维化损伤中的再生标志物而不加重瘢痕或脂肪化。
讨论总结：研究人员认为，hMDCs通过激活宿主卫星细胞和促进肌生成改善损伤微环境，其效应呈剂量依赖性，50万细胞即可达到激活肌源性程序的阈值，该阈值可能低于既往临床前研究的用量；早期代次细胞倾向于形成大量新生小纤维但短期内降低肌力，晚期代次细胞则更利于纤维成熟，提示细胞剂量与体外扩增程度需权衡优化。CTX模型中HLA与I型肌纤维的共染提示移植细胞可与宿主纤维融合，而在VML纤维化环境中细胞主要以间质定位方式发挥支持作用，融合有限。所有处理均未加重纤维化及脂肪沉积，支持自体肌源性细胞治疗SUI的安全性。研究同时指出，肌再生信号增强与功能性力量恢复并不同步，未来应在更接近EUS的括约肌损伤模型中进行尿动力学验证。
研究结论：这些结果凸显了自体MDC治疗SUI的持续发展。通过证明hMDCs可增强CTX和VML损伤组织中的肌肉再生，本研究为早期人体试验中观察到的积极结果提供了支持。不同模型也强调了研究复杂损伤情况以提高患者治疗成功率的必要性。最终，仔细优化细胞剂量、代次和递送方式，对于最大化这种致残性疾病的治疗潜力并确保长期功能获益至关重要。未来研究应扩展现有VML注射模型，纳入更多细胞代次并改变注射细胞数量，同时还应阐明不同细胞特征导致再生结局差异的机制，并探索在复杂泌尿生殖环境中提高成肌细胞存活、整合和功能贡献的策略。
