《Cell Reports》：Reduced astroglial-synapse coverage on cortical non-engram cells shapes remote memory strength
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星形胶质细胞与神经元突触作为双向伙伴调节突触传递，突触周围星形胶质细胞突起（PAPs）在海马中的重塑门控近期恐惧记忆的强度。皮层PAP重塑是否参与远程记忆巩固，以及其在内印迹与非印迹神经元突触间是否存在差异，尚不清楚。在此，研究人员展示了Astro-GRASP
星形胶质细胞与神经元突触作为双向伙伴调节突触传递，突触周围星形胶质细胞突起（PAPs）在海马中的重塑门控近期恐惧记忆的强度。皮层PAP重塑是否参与远程记忆巩固，以及其在内印迹与非印迹神经元突触间是否存在差异，尚不清楚。在此，研究人员展示了Astro-GRASP，一种遗传靶向方法，用于研究星形胶质细胞-突触相互作用。在前边缘皮层（PL）中，恐惧条件化（FC）在近期记忆巩固期间全局性增加星形胶质细胞-突触覆盖，而在学习后的远程时间点，星形胶质细胞选择性地从非印迹突触回缩。从星形胶质细胞中耗竭埃兹蛋白（ezrin）可减少局部星形胶质细胞-突触覆盖并增强远程记忆表达，证实了星形胶质细胞与皮层突触相互作用的功能相关性。综上，研究结果表明PL非印迹而非印迹神经元上的星形胶质细胞-突触覆盖塑造远程记忆强度，突显了星形胶质细胞重塑在皮层环路记忆巩固中先前未被认识到的作用。
**论文解读：皮层星形胶质细胞-突触覆盖动态调控远程记忆强度的机制研究**
**一、研究背景与科学问题**
记忆的巩固与存储是神经科学的核心议题。传统观点认为，记忆由学习时激活的稀疏神经元群体——即印迹细胞（engram cells）——所编码和存储。然而，长期以来关于记忆的研究主要聚焦于神经元本身，而对胶质细胞，特别是星形胶质细胞在记忆处理中的作用关注不足。星形胶质细胞是大脑中最丰富的胶质细胞类型，其最精细的突起——突触周围星形胶质细胞突起（perisynaptic astrocytic processes, PAPs）——包绕绝大多数突触，构成三方突触（tripartite synapse）的结构基础。PAPs不仅提供物理屏障限制神经递质溢出，还通过摄取神经递质、调节离子浓度和提供局部代谢支持等方式积极参与突触稳态的维持。星形胶质细胞对突触的覆盖是高度动态的，可响应神经元活动而变化。
已有研究在海马中发现，学习诱导的PAP回缩可调节近期恐惧记忆的强度，且星形胶质细胞特异性缺失PAP膜蛋白埃兹蛋白（ezrin）会缩短PAP并增强近期恐惧记忆表达。然而，皮层星形胶质细胞-突触相互作用的改变如何影响记忆巩固乃至远程记忆表达，目前知之甚少。皮层区域如前边缘皮层（prelimbic cortex, PL）和尾侧前扣带回皮层（caudal anterior cingulate cortex, cACC）是远程记忆（>2周）提取的关键脑区，但关于这些区域在近期和远程记忆处理过程中突触连接性的变化，尤其是星形胶质细胞参与其中的机制，尚缺乏深入研究。此外，技术上的挑战也阻碍了对特定神经元亚群（如印迹与非印迹细胞）和特定突触输入上星形胶质细胞-突触临近性的精确评估。因此，研究人员旨在探究PL皮层中星形胶质细胞与神经元突触的结构相互作用是否调节远程记忆表达，并检验cACC至PL环路连接在学习后是否随时间变化，以及星形胶质细胞的临近性是否参与这一过程。
**二、研究方法与技术**
为探究上述问题，研究人员利用小鼠恐惧条件化（fear conditioning, FC）模型，主要运用了以下关键技术方法：
1. **Astro-GRASP技术**：这是一种基于双增强绿色荧光蛋白重组跨突触伙伴（dual-eGRASP）原理开发的新型遗传靶向工具，用于在特定神经元群体上可视化星形胶质细胞-突触相互作用。该技术通过星形胶质细胞特异性启动子表达黄色pre-eGRASP，与神经元中表达的post-eGRASP相互作用，在PAP-突触界面产生荧光信号。
2. **CRISPR-Cas9介导的基因编辑**：利用星形胶质细胞特异性启动子（GfaABC1D）驱动的Cas9和靶向Ezr基因的sgRNA，实现PL星形胶质细胞中ezrin的特异性敲低。
3. **病毒示踪与TRAP技术**：结合神经元启动子（CaMKIIα）驱动的青色pre-eGRASP标记cACC至PL的投射，以及基于靶向重组激活群体（targeted recombination in activated populations, TRAP）的病毒策略，实现对学习激活的印迹细胞进行永久标记。通过不同组合，构建了cACC总投射到PL假定非印迹神经元（T-N）以及cACC印迹投射到PL印迹神经元（E-E）的标记体系。
4. **三维重建与定量分析**：采用宽场显微镜采集图像，经去卷积和三维重建后，利用Imaris软件对树突棘进行自动和人工校正的三维重构，定量分析 spine密度、星形胶质细胞接触（YFP+）、cACC输入（CFP+）及其共定位情况，并对树突棘进行分类。
**三、主要研究结果**
**1. PL中Ezrin减少增强远程记忆表达**
研究人员通过AAV介导的CRISPR-Cas9在PL星形胶质细胞中敲低ezrin，发现与对照组相比，Ezr-Cas9小鼠在条件化情境（A）中表现出增强的冻结行为，表明远程恐惧记忆表达增强。在相似情境（A′）和完全不同情境（B）中，两组小鼠的冻结水平无显著差异，说明ezrin敲低不影响记忆精度。
**2. Astro-GRASP：研究特定神经元群体星形胶质细胞-突触临近性的工具**
研究人员开发并验证了Astro-GRASP技术。结果显示，Astro-GRASP信号与GLT-1+星形胶质细胞突起和Homer1+树突棘共定位。在ezrin敲低后，YFP+树突棘的比例显著降低，而树突棘总体密度和树突干上的YFP+斑点密度不变，验证了该工具能够特异性地反映星形胶质细胞对树突棘的覆盖变化。
**3. 学习诱导PL脑区星形胶质细胞-突触接触和cACC输入的时相性与神经元群体依赖性改变**
通过Astro-GRASP结合病毒示踪，研究人员在FC后第4天（近期）和第28天（远程）分析了PL非印迹和印迹神经元的变化。
- **近期时间点**：FC降低了非印迹神经元的树突棘密度，但印迹神经元无此变化。FC增加了非印迹神经元上YFP+棘（星形胶质细胞接触）和CFP+棘（cACC输入）的比例，但在印迹神经元上，CFP+棘比例减少。FC还降低了印迹神经元上YFP+/CFP+共定位（即接收cACC输入且被星形胶质细胞接触的棘）的概率。
- **远程时间点**：非印迹和印迹神经元的树突棘密度均恢复到基线水平。FC显著降低了非印迹神经元上YFP+棘的比例，表明星形胶质细胞选择性地从非印迹突触回缩，而印迹神经元上无此变化。同时，FC增加了非印迹神经元上CFP+棘的比例，而印迹神经元无变化。远程时间点共定位分析显示，FC改变了非印迹神经元上星形胶质细胞与cACC输入接收棘的相互作用。
**4. 学习诱导cACC输入接收棘的类型分布发生近期和远程改变**
按形态将树突棘分为stubby、small mushroom、long thin和big mushroom四类。FC不改变整体树突棘类型分布，也不改变星形胶质细胞接触的棘的类型分布，但会影响cACC输入在不同类型棘上的分布。在近期时间点，非印迹神经元上cACC输入增加发生在small mushroom和big mushroom棘上，且与星形胶质细胞接触增加相关。在远程时间点，非印迹神经元上cACC输入增加特异性地发生在small mushroom和big mushroom棘上，且这些棘与星形胶质细胞的接触也增加。相比之下，印迹神经元上的变化主要发生在近期时间点。
**四、讨论与结论**
本研究发现，PL皮层中星形胶质细胞-突触相互作用在记忆巩固过程中是动态变化的，并具有神经元群体特异性。FC后近期，星形胶质细胞与印迹和非印迹神经元突触的接触均增加；而远程时间点，星形胶质细胞仅从非印迹神经元突触选择性回缩。同时，学习持续性地增加了cACC至PL非印迹神经元的输入，而cACC印迹至PL印迹神经元的输入在近期减少后维持低水平。重要的是，通过ezrin敲低人为诱导星形胶质细胞回缩可增强远程记忆表达，证实了星形胶质细胞覆盖变化对记忆的功能相关性。研究揭示，PL非印迹神经元上星形胶质细胞覆盖的减少是塑造远程记忆强度的关键因素，而非印迹神经元。这种选择性的PAP回缩可能通过允许谷氨酸溢出、促进NMDAR依赖的突触串扰，从而在记忆提取时增强PL神经元网络的激活。研究结论指出，皮层星形胶质细胞-突触的结构相互作用并非静态，而是在记忆巩固期间被动态调节，并直接影响远程记忆强度，突显了星形胶质细胞重塑在皮层环路记忆巩固中一种此前未被认识到的作用。
