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摘要
由于国际法规要求，转基因生物（GMO）事件的高效检测和定量是必要的。数字PCR（dPCR）已被广泛用于GMO的检测和定量。本研究旨在利用五重微滴数字PCR（ddPCR）和六色微滴读取仪检测和定量油菜GMO事件。第一个五重定性ddPCR检测体系包含三个元
摘要
由于国际法规要求，转基因生物（GMO）事件的高效检测和定量是必要的。数字PCR（dPCR）已被广泛用于GMO的检测和定量。本研究旨在利用五重微滴数字PCR（ddPCR）和六色微滴读取仪检测和定量油菜GMO事件。第一个五重定性ddPCR检测体系包含三个元件特异性靶标（CaMV P35S、Tnos和tE9）和两个事件特异性靶标（DP73496和MON94100），该检测体系用于检测15个油菜GMO事件。第二个五重事件特异性ddPCR检测体系设计用于检测和定量商业种植油菜品种中可发现的五个GMO事件（DP73496、GT73、RF3、MS8和MON88302）。使用第一个五重定性ddPCR在0.1%水平检测到共15个油菜GMO事件。特定GMO事件也可在0.01%和0.05%水平被检测到。使用第二个事件特异性五重ddPCR对五个主要油菜GMO事件进行了检测和定量。使用事件特异性五重ddPCR成功定量了0.1%、0.5%和1%加标DNA样品。事件特异性五重ddPCR可检测到0.01%和0.05%的DNA浓度。所开发的两种五重ddPCR检测体系将有助于促进油菜GMO事件的高效筛查和定量。
基于五重微滴数字PCR的油菜转基因事件检测研究解读
**研究背景与意义**
油菜是加拿大最具价值的农作物之一，占全国农业现金收入的25%。加拿大种植的油菜大部分为转基因（GM）品种。由于许多国家对转基因作物的种植和食品/饲料用途有法规要求，因此需要有效的检测方法。欧盟委员会法规明确规定了转基因食品和饲料的授权和标签程序。实时PCR和数字PCR（dPCR）方法已被用于转基因生物（GMO）事件的检测和定量。与实时PCR相比，数字PCR不需要标准曲线，且不易受PCR抑制剂影响。多重PCR检测可提高GMO事件检测和定量的效率，节省时间和资源。然而，使用有限颜色检测通道的多重dPCR需要仔细优化且耗时。使用具有多个颜色检测通道（如六色）的dPCR仪器将增强同时检测和定量多个GMO事件的能力。已有研究使用六色dPCR系统成功实现了四种和五种大豆GMO事件的多重鉴定和定量。本研究利用Bio-Rad QX600微滴读取仪（提供六色荧光检测），首次报道了油菜GMO事件的五重ddPCR检测。
**研究目的**
本研究旨在：1）利用包含元件特异性和事件特异性靶标的五重ddPCR同时检测15个油菜GMO事件；2）利用五重事件特异性ddPCR检测和定量商业种植油菜品种中可发现的五个GMO事件。
**实验设计与技术方法**
研究使用了多种参考物质来源进行油菜GMO事件的检测。DNA提取采用Fast DNA Spin Kit从0.2克研磨材料中提取，使用Pico Green检测法测量DNA量，以λ DNA生成校准曲线。为制备DNA混合物，将五个GMO事件各以5%（总计25%）掺入75%的非GMO油菜DNA中，较低浓度稀释液由5%储备液制备。研究开发了两种五重ddPCR检测体系：第一种为定性检测体系，包含三个元件特异性靶标（CaMV P35S、Tnos和tE9）和两个事件特异性靶标（DP73496和MON94100）；第二种为事件特异性检测体系，包含五个商业种植油菜品种中的GMO事件（DP73496、GT73、RF3、MS8和MON88302）。每个探针标记不同的荧光染料，同时包含油菜内参基因FatA引物和探针。ddPCR体系使用100 ng DNA，每个检测体系均包含重复的非GMO DNA和无非模板对照。采用Bio-Rad自动微滴生成仪进行微滴生成，PCR扩增在Eppendorf Master Cycler上进行，使用Bio-Rad ddPCR多重Supermix。热循环条件为95°C初始变性10分钟，随后50个循环的95°C 15秒、60°C 1分钟，最后98°C 10分钟。使用配备六色通道的QX600 Bio-Rad微滴读取仪测量阳性和阴性微滴的荧光信号。QuantaSoft软件配合自动阈值设定用于数据分析，通过泊松算法确定靶标DNA分子的起始浓度。
**研究结果与讨论**
**3.1 使用第一种五重ddPCR定性检测油菜GMO事件**
研究人员将三个元件特异性（CaMV P35S、Tnos和tE9）和两个事件特异性（DP73496和MON94100）引物/探针组合用于五重ddPCR检测体系，可检测15个油菜GMO事件。这15个事件占迄今报道的大部分转基因油菜事件。在0.1%水平下，五重ddPCR检测体系可检出全部15个GMO事件，每个反应获得相对较高的拷贝数，证明了0.1%水平检测的可靠性。阴性DNA对照和无非模板对照均未显示扩增，且未检测到非特异性扩增，确认了检测方法的特异性。为确定检测限，研究测试了五个GMO事件的低浓度靶DNA（0.05%和0.01%），所有20个重复均获得扩增，除MON94100在0.01%样品中显示85%扩增。RF3、DP73496和MON94100在0.01%水平获得的微滴数较低，因此这些GMO事件的检测限为0.05%。由于约95%的加拿大油菜为转基因品种，该定性五重ddPCR检测体系可用于身份保持的非GMO油菜种子品种中GMO事件的筛查。
**3.2 用于油菜GMO事件定量的事件特异性五重ddPCR**
研究优化了五种油菜GMO事件（DP73496、GT73、RF3、MS8和MON88302）检测和定量的五重ddPCR检测体系。这五个事件可在加拿大商业种植的油菜品种中发现，其主要性状为除草剂耐受性，并已在包括欧盟在内的许多国家获得监管批准。定量结果显示，以变异系数（CV）评估的方法精密度，DP73496、RF3、MS8和MON88302的CV值≤25%，而GT73的平均CV值略高于≤25%的接受标准。四个GMO事件在0.1%加标DNA样品的CV值相对高于0.5%和1%样品，但仍在25%以下。二维荧光图显示单次反应中六个等位基因的清晰检测，通过优化引物和探针浓度改善了微滴簇的分离。在检测限研究中，0.05%和0.01%加标DNA样品的所有20个重复均观察到扩增，除MS8在0.01%样品中显示95%扩增。以三个阳性微滴作为阳性判定阈值，DP73496、GT73和MON88302在0.01%水平可实现一致检测。
**讨论与结论**
研究开展了全面调查以证明五重ddPCR检测方法的可靠性。与已发表的单一或双重ddPCR检测方法相比，本研究的五重检测体系具有明显优势。使用六色检测能力的Bio-Rad QX600微滴读取仪，每个探针标记不同荧光染料，实现了五个GMO事件的同时检测和定量。五重ddPCR的使用提高了效率、降低了成本、减少了移液步骤并降低了变异性。在检测体系中纳入油菜内参基因引物对和探针也使检测更为便捷。数字PCR基于微滴分区原理，减少了引物/探针之间的竞争，这是多重定量实时PCR中常见的限制因素。
研究结论表明，多重数字PCR促进了测试样品中GMO事件的检测。第一个包含三个元件特异性和两个事件特异性靶标的五重定性ddPCR检测体系可检测15个油菜GMO事件，其中五个选定GMO事件可在0.01%和0.05%水平被检测。第二个事件特异性五重ddPCR检测体系可用于五个主要油菜GMO事件（DP73496、GT73、RF3、MS8和MON88302）的检测和定量，在0.1%、0.5%和1% DNA浓度下实现了五个GMO事件的定量，其中GT73的定量未完全满足≤25% CV标准。低DNA浓度0.01%和0.05%也可被事件特异性五重ddPCR检测体系检出。本研究首次报道了油菜GMO事件的五重ddPCR检测，所开发的检测体系将有助于促进油菜GMO事件的高效筛查和定量。
