《Biology》：Dried Blood Spot-Based Quantification Indicates Correlation Between lncRNA GAS5, Diabetes, Age, and War Eras in US Veterans
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美国退伍军人与平民相比，2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）的患病率显著更高。此前，研究人员已证实伴有T2D的退伍军人血清GAS5水平低于非糖尿病患者，并将GAS5确立为T2D的遗传生物标志物，该发现已得到其他研究团队的验证。干血斑（drie
美国退伍军人与平民相比，2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）的患病率显著更高。此前，研究人员已证实伴有T2D的退伍军人血清GAS5水平低于非糖尿病患者，并将GAS5确立为T2D的遗传生物标志物，该发现已得到其他研究团队的验证。干血斑（dried blood spots, DBS）具有采集微创、可在室温下运输等优势。目前尚无关于在DBS中测量长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）的报道，因此研究人员尝试检测从退伍军人受试者采集的DBS样本中lncRNA GAS5的水平。结果表明，在退伍军人中，年龄增长与较低的GAS5水平独立相关。比较不同战争年代的退伍军人，在本队列中，越南战争（Vietnam War, VW）退伍军人的糖尿病发病率高于海湾战争（Gulf War, GW）或其他战争年代的退伍军人。糖化血红蛋白（A1c）值大于6.5的VW退伍军人GAS5水平较低，且该关联独立于体质指数（body mass index, BMI）。在VW退伍军人中，极少数自我报告暴露于橙剂（Agent Orange, AO）的退伍军人GAS5水平更低。基于这一观察结果，研究人员评估了急性TCDD暴露小鼠模型中的Gas5水平。结果表明，在小鼠模型中，TCDD剂量与血液和DBS中测得的Gas5水平之间存在显著的负相关。总体而言，该研究证明在DBS和血液中测量的lncRNA GAS5可用于糖尿病患者生物标志物研究。这些结果支持在现役军人或服役期间有毒物暴露的退伍军人的慢性病纵向研究中应用DBS。
**基于干血斑的lncRNA GAS5定量分析：美国退伍军人糖尿病、年龄与战争年代关联研究解读**
**1. 研究背景**
美国退伍军人的2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）患病率显著高于平民群体，约四分之一的退伍军人被诊断为T2D，而平民中的这一比例约为十分之一。T2D是一种以血糖升高和胰岛素抵抗为特征的慢性疾病，常伴随心脏病、肾病、视网膜病变、神经损伤和认知障碍等并发症。肥胖和年龄增长是T2D的主要风险因素，但遗传因素仅占T2D发病风险的10%–15%，环境和生活方式等因素同样在疾病发生发展中发挥重要作用。
长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在表观遗传调控、转录、剪接和翻译等关键生物学过程中发挥功能，其异常表达与多种人类疾病相关。研究人员前期通过无偏筛选发现，在伴有T2D的退伍军人血清中，生长停滞特异性转录本5（growth-arrest specific transcript 5, GAS5/Gas5(小鼠)/SNHG2）水平低于非糖尿病受试者。绝对定量分析显示，GAS5水平低于15 ng/μL的个体患糖尿病的几率约为其他个体的十二倍。该研究将lncRNA GAS5确立为T2D的遗传生物标志物，并已得到其他研究团队的验证。后续研究进一步证实GAS5在T2D中具有因果作用，可调控胰岛素受体信号传导和葡萄糖摄取。GAS5基因多态性与冠心病和糖尿病视网膜病变相关，低GAS5水平与糖尿病肾病模型相关，且在T2D患者颈动脉粥样硬化斑块相关的调控网络中发挥作用。此外，二甲双胍治疗可升高T2D患者中偏低的GAS5水平。
干血斑（dried blood spots, DBS）技术已广泛应用于蛋白质、代谢物和病毒感染的检测。与血浆或血清检测相比，DBS检测所需血液量少、采集微创、成本低廉且可在环境温度下运输，非常适合现场采样或难以覆盖人群的检测。然而，利用DBS定量lncRNA以评估慢性病患病率在此前文献中尚未见报道。本研究旨在评估从美国退伍军人DBS样本中测量GAS5水平的可行性，并结合战争年代背景分析结果。研究人员还利用小鼠模型进一步评估了急性TCDD暴露对Gas5水平的影响及其与血糖水平的关联。
**2. 主要研究方法**
本研究纳入来自佛罗里达州坦帕市James A. Haley退伍军人医院研究生物样本库（Research Biospecimen Repository, RBR）的186份退伍军人DBS样本，样本采集于2014年4月30日至8月3日期间，所有参与者均签署知情同意书（IRB #Pro00012108）。排除标准为曾确诊任何癌症的退伍军人，因疾病及化疗可能改变GAS5水平。样本附带人口统计学信息（年龄、性别、种族背景）及研究参数（战争年代、糖尿病诊断状态、DBS采集时A1c值、自我报告橙剂暴露状态）。糖尿病状态通过查询患者病历中T2D的ICD-9编码确定。RNA提取采用优化的Trizol LS法结合RNA清洁浓缩试剂盒进行基因组DNA消化。采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对GAS5进行绝对定量，以GAPDH为内参基因。小鼠实验中，对C57BL/6J小鼠进行一次皮下注射0、0.046、0.46或4.6 μg的2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英（TCDD），一周后采用直接血液qPCR方法检测Gas5水平，并用血糖仪测量血糖。统计分析采用Spearman秩相关、Mann-Whitney U检验、受试者工作特征（ROC）曲线分析和广义线性模型等方法。
**3. 研究结果**
**3.1 参与者特征**
样本来自越南战争（VW；n=102）、海湾战争（GW；n=34）或其他战争年代（n=50）的退伍军人，各组的平均年龄分别为67.1岁、55.5岁和71.8岁。样本以男性为主（89.7%），GW退伍军人中女性比例最高（23.5%）。大多数样本来自白人和非西班牙裔退伍军人（82.1%）。
**3.2 年龄增长与较低GAS5水平独立相关**
对不同战争年代退伍军人的年龄分布分析显示，GW退伍军人年龄中位数为54岁（范围34–76），VW退伍军人为67岁（范围58–80），其他战争年代退伍军人为75岁（范围33–93）。对DBS样本进行RT-qPCR定量分析表明，lncRNA GAS5可从DBS样本中稳健测量。Spearman相关分析显示GAS5水平随年龄增长而下降，呈统计学显著的负相关（rho=?0.585，95% CI：?0.675至?0.478；p<0.0001）。多变量分析表明，年龄每增加一岁，GAS5绝对定量值对应下降1.35 ng，年龄是GAS5水平的显著负向预测因子（B=?1.35，95% CI：?1.75至?0.95，Wald χ2(1)=44.01，p<0.001）。
**3.3 DBS中GAS5水平与糖尿病和A1c值呈负相关**
伴有T2D诊断的退伍军人GAS5水平显著低于非糖尿病退伍军人（Mann-Whitney检验，p<0.0001）。Spearman相关分析显示GAS5水平与A1c值之间存在高度显著的负相关（rho=?0.242，95% CI：?0.377至?0.097；p=0.001）。ROC曲线分析显示，以A1c>6.5为判定标准时，GAS5的曲线下面积（AUC）为0.6537（95% CI：0.5714至0.7361；p=0.0018），最佳截断值为GAS5绝对定量14.42，灵敏度为71.7%。以T2D诊断状态分析的ROC结果相似（AUC：0.6542；95% CI：0.5724至0.7360；p=0.0006）。
**3.4 VW退伍军人的GAS5水平低于其他战争年代退伍军人**
按战争年代分组分析显示，VW退伍军人的平均GAS5水平低于GW和其他战争年代退伍军人合并组。非VW退伍军人的平均GAS5绝对定量为34.7 ng，而VW退伍军人为18.5 ng，表达差异接近2倍（Mann-Whitney检验，p=0.0048）。广义线性模型分析显示，战争年代与GAS5绝对定量显著相关（Wald χ2(2)=11.84，p=0.003），与其他战争年代组相比，VW年代参与者的GAS5绝对定量显著更低（B=?10.927，95% CI：?17.943至?3.912，p=0.002）。
**3.5 VW退伍军人T2D发病率较高伴随GAS5水平较低**
在本队列中，38.2%的VW退伍军人、17.1%的GW退伍军人和34.0%的其他战争年代退伍军人患有糖尿病（卡方检验：11.92；df：2；p=0.0026）。在VW退伍军人中，病历中有T2D诊断编码者的GAS5水平显著低于无诊断者（Mann-Whitney检验，p=0.0271）。按A1c值分层分析显示，A1c>6.5的VW退伍军人GAS5水平显著低于A1c<6.5者（Mann-Whitney检验，p=0.0324）。
**3.6 VW退伍军人低GAS5水平与BMI无关**
鉴于BMI>30与A1c值之间已知的关联，研究人员分析了GAS5水平与BMI之间的相关性。结果显示，在VW退伍军人中GAS5水平与BMI之间无相关性（rho=0.0253，95% CI：?0.179至?0.228；p=0.804），在所有退伍军人中仅呈弱相关。广义线性模型显示，肥胖状态（BMI>30）与GAS5结果之间无关联（B=0.00，95% CI：?6.18至6.18，Wald χ2(1)=0.00，p=1.000）。
**3.7 少数自我报告橙剂暴露的VW退伍军人GAS5水平较低**
在VW退伍军人中，自我报告AO暴露者的GAS5水平低于未暴露者，非暴露与较高的GAS5绝对定量相关联（B=10.332，95% CI：4.178至16.485，p<0.001）。但该发现需谨慎解读，因为本队列中仅有5名参与者报告了AO暴露，且这些个体在DBS采集时均未接受糖尿病治疗。其中一名报告处理过AO的退伍军人A1c值为本研究中最高的9.6，另外三名退伍军人的A1c值处于前驱糖尿病范围（5.7–6.4）。
**3.8 小鼠急性TCDD暴露导致循环Gas5剂量依赖性下降伴随血糖升高**
为验证AO暴露观察结果，研究人员利用小鼠模型评估TCDD暴露对Gas5水平的影响。C57BL/6J小鼠接受单次0、0.046、0.46或4.6 μg TCDD注射，一周后测量血液Gas5和葡萄糖水平。结果显示，TCDD产生了显著的剂量依赖性循环Gas5水平下降（One-way ANOVA），血糖随TCDD暴露升高后趋于平台期。Gas5水平的下降与体重无关，实验期间未观察到体重、摄食或理毛行为的显著变化。Gas5水平与TCDD剂量之间呈显著负相关（Pearson相关系数r=?0.4108；95% CI：?0.6985至?0.009；p=0.0461）。此外，配对比较显示，来自同一小鼠的DBS与全血样本中Gas5绝对定量水平相当（Student非配对t检验，p=0.0518）。
**4. 讨论与结论**
本研究证明了利用DBS测量退伍军人队列中lncRNA GAS5水平的可行性。年龄增长与GAS5水平降低独立相关，这与衰老过程中慢性氧化应激导致的胰岛素分泌减少和胰岛素抵抗增加的生理变化相符。按战争年代分层分析时，VW退伍军人的T2D患病率高于GW或其他战争年代退伍军人，且伴随较低的GAS5水平。
服役相关暴露是影响GAS5水平和T2D发展的另一潜在因素。越战期间，橙剂（Agent Orange, AO）被广泛用于清除植被以减少越共武装的掩蔽。AO是2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）的1:1混合物，而2,4,5-T的副产物是二噁英类内分泌干扰物TCDD。在"牧场手"行动中，超过1100万加仑的AO通过C-123飞机空中喷洒，使附近地面部队暴露于该物质。由于当时防护措施有限，处理和喷洒AO的人员暴露尤为严重。已有研究表明TCDD暴露可导致胰岛素抵抗状态，纵向研究将"牧场手"退伍军人同时与糖尿病和血清高TCDD水平相关联。目前糖尿病已成为VW退伍军人的推定疾病。
在本研究中，尽管只有5名退伍军人报告了AO暴露，但这些样本的GAS5表达水平显著低于未暴露退伍军人。许多VW退伍军人可能在服役期间不知不觉地间接暴露于AO，这可能有助于解释该群体中普遍观察到的较低GAS5水平。鉴于自我报告样本量极小和报告偏倚风险，研究人员采用TCDD暴露小鼠模型进行更直接的验证。小鼠实验中，TCDD注射导致循环Gas5水平下降，同时血糖升高，且与体重变化无关。这些结果表明Gas5是TCDD的靶标，并显示Gas5与TCDD暴露剂量之间存在负相关关系。由于既往研究已表明低GAS5水平对T2D具有因果作用，且GAS5可调控胰岛素受体信号传导和葡萄糖摄取，这些结果提示TCDD诱导的GAS5耗竭与急性高血糖之间可能存在关联。
研究局限性包括：未来应优先收集更多自我报告处理AO或确诊AO暴露的退伍军人样本以增加统计效力；小鼠实验仅在暴露后1周评估了对TCDD的反应，显示高血糖但不一定代表胰岛素抵抗；仍需进行纵向慢性TCDD暴露小鼠模型以及胰岛素水平、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性等额外糖尿病检测，以阐明TCDD暴露、GAS5水平和糖尿病病理学之间的机制关系。
总之，本研究证实了从DBS中测量lncRNA GAS5的可行性。该方法具有所需血液量少（指尖采血滴即可）、储存和运输方便（室温短期运输）等优势。这些发现表明，lncRNA血液生物标志物可从DBS中稳健测量，支持将DBS应用于现役军人或服役期间有毒物暴露退伍军人的慢性病纵向研究中。更广泛地说，DBS采集可推广至远离医疗诊所的退伍军人和平民，以促进慢性病诊断和预后的遗传生物标志物检测。
