《Life》：Immunogenic Cell Death Induced by EEO in Breast Cancer Cells Promotes Dendritic Cell Activation in a CRT-Dependent Manner
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癌症免疫治疗在治疗“冷”肿瘤方面面临重大挑战，这类肿瘤对现有策略反应不佳。乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因，是一种代表性的免疫抑制性“冷”肿瘤。乳腺癌的腔上皮A（Luminal A）亚型表现出免疫冷表型，其中MCF-7细胞被用作代表性细胞模型。在此，研究人员
癌症免疫治疗在治疗“冷”肿瘤方面面临重大挑战，这类肿瘤对现有策略反应不佳。乳腺癌是女性癌症相关死亡的主要原因，是一种代表性的免疫抑制性“冷”肿瘤。乳腺癌的腔上皮A（Luminal A）亚型表现出免疫冷表型，其中MCF-7细胞被用作代表性细胞模型。在此，研究人员鉴定出从东方裸伞（*Gymnopilus orientispectabilis*）中分离得到的(3β,5α,8α)-5,8-epidioxyergost-6-en-3β-ol（EEO）作为MCF-7细胞中免疫原性细胞死亡（ICD）标志物的诱导剂，这些标志物包括钙网蛋白（CRT）的细胞表面暴露以及损伤相关分子模式（DAMPs）的细胞外释放，如三磷酸腺苷（ATP）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）。这些ICD相关事件随后在骨髓来源树突状细胞（BMDCs）与MCF-7细胞共培养体系中，以CRT依赖性方式促进了树突状细胞（DC）的活化。此外，表面暴露的CRT增强了DC对EEO处理的MCF-7细胞的吞噬作用，且该吞噬活性促进了DC成熟，这体现在成熟标志物主要组织相容性复合体II类（MHC II）和分化簇86（CD86）的细胞表面水平升高。并且，在MCF-7细胞中敲低CRT可减少EEO处理后细胞表面CRT的暴露，从而抑制DC介导的吞噬作用及随后的DC成熟。总之，这些发现表明，EEO是一个有前景的候选药物，可通过ICD介导的DC成熟增强现有乳腺癌免疫疗法的抗肿瘤功效，并将免疫学“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。
论文解读：EEO通过CRT依赖性免疫原性细胞死亡激活针对乳腺癌的树突状细胞抗肿瘤免疫
癌症免疫治疗作为前沿治疗策略，在恶性肿瘤治疗中展现出巨大潜力，然而其临床疗效在包括乳腺癌在内的多种实体瘤中受到显著限制。这些肿瘤常表现为免疫学“冷”肿瘤，其肿瘤微环境（TME）中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）浸润和活化不足，导致免疫逃逸和对免疫治疗的低反应性。乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因，其腔上皮A（Luminal A）亚型尤为典型地呈现免疫冷表型。因此，将“冷”肿瘤转化为免疫细胞浸润和活化的“热”肿瘤，成为提升乳腺癌免疫治疗效力的关键策略。诱导免疫原性细胞死亡（ICD）是实现这一转化的有效途径之一。ICD作为一种调节性细胞死亡形式，能够释放损伤相关分子模式（DAMPs）并在细胞表面暴露钙网蛋白（CRT），从而激活树突状细胞（DC），促进肿瘤抗原的交叉提呈，最终激发肿瘤特异性免疫应答。然而，目前临床可用的ICD诱导剂十分有限，且多为化疗药物，毒副作用较大。天然化合物因其多样化的生物活性和较低的毒性，被视为寻找新型ICD诱导剂的重要来源，但相关发现仍极其匮乏。在此背景下，研究人员聚焦于从东方裸伞（Gymnopilus orientispectabilis）中分离的天然甾醇(3β,5α,8α)-5,8-epidioxyergost-6-en-3β-ol（EEO），探究其是否具有诱导ICD并激活DC的抗肿瘤免疫潜力。该研究证实了EEO能够以CRT依赖性方式在乳腺癌细胞中诱导ICD并激活DC，为将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤提供了一种极具潜力的候选策略，为开发基于EEO的癌症免疫疗法奠定了理论基础。该研究成果发表于《Life》。
本研究针对的核心问题是EEO能否作为ICD诱导剂，以及其如何通过细胞表面暴露的CRT介导DC的吞噬和成熟，进而启动抗肿瘤免疫。研究得出的主要结论包括：EEO以亚IC50浓度（100 μM）诱导MCF-7细胞凋亡并呈现ICD特征；EEO处理的肿瘤细胞能够显著促进BMDCs的吞噬和成熟，且该过程依赖于CRT的细胞表面暴露。该研究首次揭示了EEO在免疫调节中的新功能与其在癌症免疫治疗中的应用潜力。
该研究采用的关键技术方法包括：利用MTT法、台盼蓝染色、集落形成实验及Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术评估细胞活力与凋亡；通过Western blot检测凋亡相关蛋白（p53、Bax、Bcl-2、剪切型PARP）及内质网应激标志物（ATF4、CHOP）表达；使用流式细胞术和激光共聚焦扫描显微镜检测CRT的细胞表面暴露；通过免疫荧光染色评估HMGB1和ATP的释放；采用小干扰RNA（siRNA）技术敲低CRT表达；从小鼠（C57BL/6，8-9周龄，购自Koatech）骨髓中分离细胞并体外诱导分化为BMDCs；通过共培养实验结合流式细胞术分析BMDC的吞噬活性及成熟标志物（MHC II和CD86）表达。样本来源：MCF-7细胞系由公州国立大学提供。
研究结果部分主要包含以下四个方面的发现：
**3.1 EEO通过凋亡在MCF-7乳腺癌细胞中诱导细胞毒性**。研究人员通过MTT实验和台盼蓝染色发现，EEO在100 μM浓度下显著降低MCF-7细胞活力，并抑制集落形成。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术进一步证实EEO诱导凋亡细胞比例增加。Western blot结果显示，EEO上调促凋亡蛋白p53和Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2，并促进PARP的剪切。此外，EEO还上调内质网应激标志物ATF4和CHOP的表达，表明EEO通过激活内质网应激相关的凋亡通路发挥细胞毒性作用。
**3.2 EEO在MCF-7乳腺癌细胞中诱导ICD特征**。研究人员利用流式细胞术检测到EEO处理显著增加细胞表面CRT暴露，且呈时间依赖性，处理24小时后较对照组增加约1.8倍；激光共聚焦显微镜进一步观察到细胞表面CRT荧光强度显著增强（约9倍）。qRT-PCR分析显示CRT mRNA水平上调。同时，通过免疫荧光检测发现，EEO处理后细胞内HMGB1荧光减弱，且ATP敏感的奎纳克林染色荧光降低，表明EEO诱导了HMGB1和ATP的细胞外释放。上述结果证实EEO能够诱导细胞表面CRT暴露以及DAMPs分泌，具备ICD的分子特征。
**3.3 EEO处理的MCF-7乳腺癌细胞促进BMDC的吞噬和成熟**。研究人员将CypHer 5E标记的、经EEO处理的MCF-7细胞与BMDCs共培养后，流式细胞术检测发现BMDC的吞噬活性显著增强。进一步分析显示，共培养后BMDCs表面成熟标志物主要组织相容性复合体II类（MHC II）和分化簇86（CD86）表达上调。同时，qRT-PCR检测到促炎细胞因子IL-1β和IL-6 mRNA表达水平显著增加。这些结果表明，EEO诱导的肿瘤细胞死亡能够被DC有效识别并吞噬，进而促进DC成熟，并建立促炎性的微环境。
**3.4 EEO诱导的CRT表面暴露是BMDC吞噬和成熟所必需的**。研究人员通过siRNA敲低MCF-7细胞中CRT表达后，发现EEO诱导的细胞凋亡并未受影响，但EEO处理后的细胞表面CRT暴露显著减少。在共培养体系中，BMDCs对CRT敲低肿瘤细胞的吞噬能力显著降低，且BMDC的成熟（CD86和MHC II表达下调）受到明显抑制。这一结果明确了表面暴露的CRT作为“eat-me”信号，在EEO介导的DC吞噬和成熟中发挥着不可替代的关键作用。
在讨论部分，研究人员指出，EEO作为从东方裸伞中分离的天然甾醇，此前仅报道其抗菌活性，本研究首次证实其具有ICD诱导相关的免疫刺激活性。为准确评估ICD特征，研究选取了亚IC50浓度（100 μM），以避免过度细胞毒性引起的DAMP被动释放和结果混淆。EEO诱导的凋亡与内质网应激途径有关，这与已知ICD诱导剂作用机制一致。细胞表面暴露的CRT通过与DC表面的CD91受体结合，促进凋亡细胞的吞噬和抗原递呈。尽管CRT敲低显著抑制了BMDC的吞噬和成熟，但并未完全消除，提示其他“eat-me”信号（如磷脂酰丝氨酸）可能协同参与了凋亡细胞的清除。该研究验证了CRT作为ICD介导抗肿瘤免疫的关键决定因素，与既往研究结论相符。
研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员证明了EEO能够诱导ICD并促进CRT依赖的DC激活，凸显了其作为天然ICD诱导剂的潜力。这些发现为开发基于EEO的治疗策略奠定了基础，该策略旨在将免疫学上的“冷”乳腺癌肿瘤转化为“热”肿瘤，以增强癌症免疫治疗。然而，EEO诱导的免疫原性细胞死亡的治疗效果和安全性应在免疫功能正常、荷瘤动物模型和临床研究中进一步评估。
