《Vaccines》：How Does Inter-Epitope Spacer Variation Within Artificial Immunogens Based on T-Cell Epitopes of Tick-Borne Encephalitis Virus Affect Immunogenicity?
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背景/目标：近年来，研究人员在开发针对病毒感染的疫苗（包括蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus, TBEV））时，相当关注T细胞应答的激活。开发有效且安全的T细胞疫苗的一个特别有前景的方法是使用人工多表位免疫原。连接构建体内
背景/目标：近年来，研究人员在开发针对病毒感染的疫苗（包括蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus, TBEV））时，相当关注T细胞应答的激活。开发有效且安全的T细胞疫苗的一个特别有前景的方法是使用人工多表位免疫原。连接构建体内表位的间隔序列的选择可对多表位构建体的免疫原性产生显著影响。本研究的目标是使用不同间隔序列设计多表位TBEV免疫原，并评估其免疫原性。方法：本研究涉及三种多表位免疫原的设计，这些免疫原基于TBEV蛋白的T细胞表位开发。AG1-ub构建体含有优化的丙氨酸间隔序列，AG2-ub构建体含有GPGPG间隔序列，AG4-ub构建体不含间隔序列。随后生产了三种编码所设计免疫原的DNA疫苗。为评估构建体的免疫原性，研究人员通过电穿孔用所设计的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠。结果：ELISpot实验表明，编码AG1-ub和AG4-ub的DNA疫苗诱导了显著数量的IFN-γ产生细胞。编码AG2-ub（一种含GPGPG间隔序列的多表位构建体）的DNA疫苗表现出低免疫原性，这可能归因于AG2-ub蛋白加工不足或错误折叠，从而影响了分子的结构。结论：本研究提供的关于间隔序列对多表位构建体免疫原性影响的数据，可用于优化疫苗候选物的设计。然而，还需要进一步研究来评估其临床潜力。
**基于间隔序列优化的蜱传脑炎病毒多表位DNA疫苗免疫原性比较研究解读**
**1. 研究背景与问题**
蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus, TBEV）属于黄病毒科（Flaviviridae），是引起蜱传脑炎的重要病原体，每年在全球范围内导致约10,000至15,000人感染。近年来，TBEV感染发病率呈上升趋势，病毒传播范围不断扩大，且病毒具有突变能力，这些因素均对现有预防策略提出了挑战。目前获许可的TBEV疫苗基于灭活病毒制备，能诱导保护性免疫应答，但需要多次接种。这类疫苗主要激发体液免疫应答，然而中和抗体仅在疫苗接种者血清中维持5至10年。有观点认为，这类疫苗诱导的T细胞应答较弱，可能是其免疫持久性有限的原因之一。
在此背景下，人工多表位T细胞免疫原被认为是开发有效且安全T细胞疫苗的一种有前景的策略。其相较于传统疫苗的关键优势在于能够将来自多种病毒蛋白的表位组合到单一分子中。然而，多表位免疫原的开发面临诸多挑战，其中表位连接间隔序列（spacer）的选择是决定构建体免疫原性的关键因素之一。间隔序列是连接合成蛋白结构域的专门序列，分为刚性间隔序列（如(EAAAK)n）和柔性间隔序列（如GGGS）。目前，关于间隔序列对构建体免疫原性影响的研究仍相对不足，许多研究局限于理论预测，缺乏在单一模型系统内对不同间隔序列策略进行系统的实验比较。
**2. 研究目的与意义**
本研究以TBEV为模型，旨在设计采用不同间隔序列策略的多表位免疫原，并通过实验评估其免疫原性。研究系统地比较了含优化丙氨酸间隔序列（AG1-ub）、GPGPG柔性间隔序列（AG2-ub）及无间隔序列（AG4-ub）的三种DNA疫苗构建体，为多表位疫苗设计中间隔序列的合理选择提供了实验依据。该研究发表于《Vaccines》期刊。
**3. 关键技术方法**
研究首先从免疫表位数据库（Immune Epitope Database, IEDB）2.22中获取鼠源黄病毒T细胞表位数据，经与TBEV蛋白质组比对、同源性筛选以及NetMHCpan-4.1和NetMHCIIpan-4.0软件预测，选择BALB/c小鼠（H-2d单倍型）主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）I类和II类分子限制性表位，最终确定13个寡肽片段。利用PolyCTLDesigner软件设计三种多表位免疫原，采用pVAX1质粒载体构建DNA疫苗。通过电穿孔免疫BALB/c小鼠，使用酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot assay, ELISpot）检测脾细胞中分泌干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）的细胞数量，并使用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测血清中针对TBEV E蛋白的特异性抗体。动物实验方案经FBIS SSC VB「Vector」Rospotrebnadzor机构动物护理与使用委员会批准。
**4. 研究结果**
**4.1 多表位免疫原的设计**：通过IEDB数据挖掘和MHC结合预测，从TBEV包膜蛋白（E）、非结构蛋白1（NS1）、丝氨酸蛋白酶（NS3）和RNA依赖性RNA聚合酶（NS5）中筛选出13个寡肽片段。三种构建体AG1-ub、AG2-ub和AG4-ub采用相同的表位顺序，仅在间隔序列上有所不同：AG1-ub含有利用PolyCTLDesigner优化的含丙氨酸间隔序列[A][KHR]；AG2-ub含GPGPG柔性间隔序列；AG4-ub无间隔序列。所有构建体的N端添加泛素（ubiquitin），C端添加标记表位EPFRDYVDRFYKTLR和通用T辅助表位PADRE（AKFVAAWTLKAAA）。AlphaFold预测的三维结构及PSIPRED预测的二级结构显示三种蛋白在结构上无显著差异，理化性质亦相近。
**4.2 DNA质粒的构建与表达验证**：三种人工基因经密码子优化后克隆至pVAX1载体，获得pVAX-AG1-ub、pVAX-AG2-ub和pVAX-AG4-ub质粒。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）证实三种构建体在HEK293细胞中均可转录产生预期大小的mRNA。蛋白质印迹（Western blotting）检测显示，AG1-ub和AG4-ub蛋白以两种形式存在：去泛素化的全长蛋白及一系列离散加工产物条带，提示存在特异性加工过程。相比之下，AG2-ub仅检测到加工后的形式，主要条带约为30 kDa，约为理论分子量（50.2 kDa）的一半，且总蛋白产物量低于其他两种构建体，提示AG2-ub蛋白可能经历了过度加工或降解。
**4.3 免疫原性评价**：ELISpot分析显示，在第21天加强免疫后14天，pVAX-AG1-ub和pVAX-AG4-ub组小鼠脾细胞在特异性肽库刺激下产生IFN-γ的细胞数量显著高于对照组；两组间差异未达统计学显著水平，但AG1-ub组呈更高趋势。pVAX-AG2-ub组及对照组（空载体pVAX1、商品化疫苗Tick-E-Vac和未免疫组）的T细胞应答均处于背景水平。ELISA检测显示，仅商品化疫苗组小鼠血清中检测到高滴度的抗TBEV E蛋白抗体，三种DNA疫苗组均未检测到特异性抗体，这与设计预期一致——多表位构建体仅含T细胞表位，不含B细胞表位。
**5. 讨论与结论**
关于AG2-ub低免疫原性的机制，研究人员提出了两种假说：其一，过度柔性的GPGPG间隔序列可能导致整个分子不稳定甚至聚集，使蛋白被引导至溶酶体降解途径；其二，甘氨酸和脯氨酸富集的间隔序列可能阻碍蛋白酶体的最优切割功能，影响蛋白加工和表位呈递。值得注意的是，既往研究中GPGPG间隔序列在某些多表位疫苗中表现良好，说明间隔序列的适用性可能取决于具体的表位组合和疫苗平台。
本研究提供的实验证据表明，间隔序列的选择对多表位T细胞DNA疫苗的免疫原性有显著影响。利用PolyCTLDesigner优化的含丙氨酸间隔序列（AG1-ub）和无间隔序列（AG4-ub）构建体均能诱导显著的病毒特异性T细胞应答，而GPGPG间隔序列（AG2-ub）构建体免疫原性较低，可能与其蛋白加工异常有关。本研究存在一定局限性，包括结论仅适用于BALB/c小鼠（H-2d单倍型）模型，AG2-ub低免疫原性机制有待进一步通过蛋白酶体抑制剂等实验验证，以及更大规模研究将有助于优化间隔序列策略。总体而言，这是首个系统比较不同间隔序列策略对TBEV多表位疫苗免疫原性影响的实验研究，为多表位疫苗的合理设计提供了重要参考。
