单核转录组学研究揭示了ITGA8调控的成纤维细胞重塑在风湿性瓣膜性心房颤动中的作用

《iScience》：Single nucleus transcriptomics reveals ITGA8-driven fibroblast remodeling in rheumatic valvular atrial fibrillation

　　亮点：
- 单核RNA-seq技术映射了风湿性瓣膜性心房颤动（AF）中心房细胞的状态
- 在风湿性瓣膜性AF中，一种富含ITGA8的FB-C2-ELN成纤维细胞亚群扩增
- ITGA8促进成纤维细胞的增殖、迁移和细胞外基质的产生
- 针对成纤维细胞的ITGA8敲低显著降低了心房纤维化和AF的发生风险

摘要：
与风湿性瓣膜疾病相关的心房颤动（AF）涉及心房心肌的复杂重塑。通过对健康供体和持续性风湿性瓣膜性AF患者的左心房组织进行单核RNA测序，发现了主要心脏细胞群体中的疾病相关转录变化。成纤维细胞表现出显著的异质性，其中一种富含ITGA8的FB-C2-ELN亚群与细胞外基质的重塑有关。功能实验表明，ITGA8促进心脏成纤维细胞的增殖、迁移和基质产生。在ACh/CaCl2诱导的大鼠模型中，针对成纤维细胞的ITGA8抑制显著减少了心房纤维化和AF的发生风险。这些发现定义了与心房重塑相关的细胞状态，并强调了成纤维细胞ITGA8信号通路在纤维化相关AF进展中的作用。

图形摘要

引言：
单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq）技术已成为识别健康和病变人体组织中不同细胞类型的重要研究工具，从而帮助我们更深入地理解疾病的病理机制。单细胞测序技术的出现彻底改变了我们详细分析细胞群体并揭示所有人体器官中特定疾病相关细胞状态的能力。这些强大技术的快速发展显著增强了我们在单细胞水平上研究复杂生物系统的能力，为了解不同组织和疾病状态下细胞群体的异质性和功能提供了宝贵的见解。心房颤动（AF）是最常见的心律失常疾病之一，与血栓形成、中风和心力衰竭有关，导致死亡率和残疾率的显著增加。据估计，成人中AF的发病率约为1%–2%，而在老年人群中的发病率高达12%。由于随着人口老龄化，AF患者数量预计将增加，因此明确AF疾病的发病机制并寻找新的治疗靶点变得至关重要。

近年来，snRNA-seq技术已成功应用于健康和病变心脏（包括心力衰竭、扩张型心肌病（DCM）和其他心血管疾病（CADs），有助于深入揭示心脏细胞群体和疾病特异性亚群的组成。这些snRNA-seq研究不仅揭示了心肌细胞（CMs）的显著细胞多样性，还揭示了非心肌细胞（如内皮细胞（ECs）、成纤维细胞、髓系细胞和神经细胞）的多样性。据报道，心房心脏细胞的转录谱与心室心脏细胞显著不同。然而，关于人类心房心脏细胞群体的细胞多样性和转录特征知之甚少，且缺乏将单核测序技术应用于人类AF心脏的研究。

在这项研究中，我们应用snRNA-seq技术解析了来自健康受试者和瓣膜性AF（VAF）患者的单体心脏样本中的单细胞转录组。我们的分析鉴定了12种主要心脏细胞类型，并揭示了每种细胞群体内的多样性。更重要的是，我们发现某些细胞类型表现出与VAF相关的基因表达模式，表明这些特定细胞类型可能在VAF的发展和进展中起作用。我们的结果为研究人员和医生提供了揭示人类VAF细胞生物学的宝贵资源。通过提供不同心脏细胞类型基因表达谱的详细信息，我们阐明了VAF的分子和细胞机制。此外，我们的结果还确定了潜在的VAF相关靶点，这可能最终有助于开发新的VAF治疗方法。

由于心房纤维化和电重构为AF的维持提供了基础，并且存在“AF导致AF”的现象，因此干扰疾病相关调节因子的功能至关重要。ACh-CaCl2诱导的大鼠模型已被广泛用于模拟由自主神经激活、钙负荷过载和心房重构驱动的AF易感性。因此，为了补充我们的人类snRNA-seq图谱和成纤维细胞检测方法，我们在该模型中引入了基于腺相关病毒9（AAV9）的ITGA8干预，以评估调节ITGA8相关重构程序是否会影响体内心脏功能和AF的易感性。

结果：
通过snRNA-seq分离和分析心脏细胞组：
我们从3名无疾病供体（窦性心律 [SR] 组）和3名VAF患者（VAF组）获取了左心房附肢（LAA）心脏组织样本，以定义SR和VAF人心脏的细胞和转录图谱。基线特征见表S1。然后使用10× Genomics 3? Single Cell平台对LAA的透壁心肌样本进行了snRNA-seq（n = 6）。单核文库被测序并比对到人类参考基因组，经过质量控制（QC）后，使用Harmony和Seurat进行了无监督聚类、整合和差异表达分析（图1A）。我们的研究整合了健康和VAF患者的数据。经过QC过滤后，我们获得了共计37,425个核（图S1A–S1C），VAF样本的独特分子索引（UMI）和特征计数低于SR样本（图S1B和S1C，Wilcoxon检验，p < 0.001）。最终整合的数据集包括12种主要细胞类型（图1B），包括成纤维细胞、CMs、单核细胞/巨噬细胞、周细胞、血管ECs、平滑肌细胞、淋巴细胞、神经元、脂肪细胞、淋巴ECs、心内膜和心外膜。

图1 健康和VAF人心脏的细胞组成
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(A) snRNA-seq实验设计的示意图。在供体心脏采集过程中，从左耳附肢获取了透壁切片，用于性别和年龄比较（snRNA-seq，n = 3 SR，n = 3 VAF）。
(B) 经过QC和数据过滤后，37,425个核的无监督均匀流形近似和投影（UMAP）降维。
(C) 通过snRNA-seq识别的细胞类型的标记基因。颜色代表平均表达量，点大小代表表达该标记基因的细胞百分比。我们使用FLT1、PTPRB和ADGRL4作为血管内皮细胞标记；MYH11、LMOD1和ACTA2作为平滑肌细胞标记；RGS5、ABCC9和PDGFRB作为周细胞标记；NRXN1、SORCS1和NRXN3作为神经元标记；CSF1R、MRC1和MSR1作为单核细胞/巨噬细胞标记；SKAP1、TRAC和THEMIS作为淋巴细胞标记；FLT4、PROX1和CCL21作为淋巴内皮细胞标记；DCN、FBLN1和FBN1作为成纤维细胞标记；PRG4、BNC1和WT1作为心外膜标记；LEPR、BNMPER和NPR3作为心内膜标记；RYR2、CHRM2和KCNJ3作为心肌细胞标记；PLIN1、PNPLA2和PNPLA3作为脂肪细胞标记。
(D) 故意显示所有6个心脏样本（3个健康和3个VAF心脏样本）中细胞的比例的饼图。我们的研究整合了健康和VAF患者的数据。

细胞身份通过细胞特异性标记基因的表达确定（图1C）。如图1D所示，在整个群体中，成纤维细胞的比例最高（35.6%），其次是CMs（20.0%）和ECs（13.2%）。由于成纤维细胞、CMs、ECs和单核细胞/巨噬细胞构成了心脏中的四大主要细胞群体，我们选择重点分析VAF对这些主要心脏细胞群体的影响。

成纤维细胞的亚群划分及随后的心脏纤维化相关基因表达分析：
基因差异表达分析显示，许多与细胞外基质（ECM）相关的基因（COL24A1、COL8A1、COL3A1、COLGALT2、COL15A1、FN1、LTBP4、COL21A1、LAMB1和SPARC）在VAF样本中显著上调（假发现率[FDR]调整后的p < 0.05 [且|log2FC| > 0.5][倍数变化]（图2A）。对整合数据集进行无监督聚类后，发现了六个不同的成纤维细胞亚群（图2B和2C）。我们根据它们的转录特征和与已建立的心脏成纤维细胞图谱的对齐情况对这些亚群进行了分类。具体来说，在SR中主要观察到两个主要亚群：以SCN7A为特征的主要成纤维细胞（FB）-C0-SCN7A，以及FB-C1-PLA2G2A（图2B和2C）。我们还观察到了其他次要的成纤维细胞亚群，包括FB-C2-ELN、FB-C3-ribosome/metabolism、FB-C4-PCOLCE2和FB-C5-CCL2（图2B和2C）。值得注意的是，FB-C1、C2、C4和C5的表达谱与Koenig等人先前描述的成纤维细胞状态高度一致（分别为Fb4、Fb5、Fb2和Fb7），而FB-C3则因其富集的核糖体和代谢程序而被独特定义。

图2 通过亚群分析得到的VAF相关心脏成纤维细胞亚群
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(A) VAF和SR心脏成纤维细胞中ECM相关基因的表达模式。每个样本的基因表达水平是通过计算该样本内所有细胞的平均表达值获得的。六个样本的平均表达水平被标准化为Z分数。
(B) 通过UMAP降维方法可视化了六个功能不同的成纤维细胞亚群。颜色分别代表六个成纤维细胞亚群。
(C) 在SR（左）和VAF（右）中六个成纤维细胞亚群的分布。
(D) 按伪时间（left）和成纤维细胞亚群（right）着色的Monocle2轨迹分析。
(E和F) 不同成纤维细胞亚群在伪时间上的密度曲线。
(G) 条形图显示了SR（蓝色）和VAF（橙色）中六个成纤维细胞亚群的比例。数据以均值 ± 标准误差（S.E.M.）显示。两组之间的比较使用了t检验。

Monocle分析表明，在较低的伪时间下，FB-C3-ribosome/metabolism显示出较高的稳态成纤维细胞特征，而在较高的伪时间下，FB-C2-ELN表现出ECM和肌成纤维细胞相关程序的上调（图2D–2G）。在VAF患者中，FB-C2-ELN组处于最高的伪时间位置，而在SR组中，FB-C5-CCL2处于最高的伪时间位置（图2D–2F），表明FB-C2-ELN与VAF的发病机制密切相关。所有其他成纤维细胞似乎都处于高熵状态，表明这些群体具有很大的可塑性（图2D–2F）。比较成纤维细胞状态的通路分析发现了不同的通路富集，包括在FB-C0-SCN7A和FB-C2-ELN中富集的ECM合成和组装，在FB-C1-PLA2G2A中富集的TGF-β信号，在FB-C3-ribosome/metabolism中富集的干扰素γ反应，在FB-C4-PCOLCE2中富集的上皮-间质转化，在FB-C5-CCL2中富集的白细胞介素信号（图3A）。我们对人类心脏的进一步组织学分析验证了VAF心脏中的病理学心脏纤维化（图3B和3C）。

图3 VAF心脏中成纤维细胞亚群的通路富集和心脏纤维化
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(A) 六个成纤维细胞亚群中差异表达基因富集的通路。GeneRatio表示特定通路中DEGs与该通路中总基因数的比率。颜色表示通过通路富集分析调整后的p值。
(B) SR和VAF心脏的H&E和Masson染色代表图像，以及心房中心脏纤维化百分比的量化（n = 2–8，每个生物重复实验包含五个技术重复实验，p < 0.0001）。比例尺，200 μm。我们的研究整合了健康和VAF患者的数据。
(C) 控制或VAF心脏中纤连蛋白免疫染色的代表图像，以及纤连蛋白+成纤维细胞的量化。实验进行了2–5次生物重复实验，每个包含五个技术重复实验（p < 0.0001）。

数据以均值 ± 标准误差（S.E.M.）显示，比例尺，50 μm；两组之间的比较使用了t检验；在本研究中，p < 0.05被视为统计学显著。?p < 0.05，??p < 0.01，??p < 0.01，???p < 0.001。

差异基因表达分析显示ITGA8参与VAF相关的FB-C2-ELN：
值得注意的是，我们发现ITGA8在心脏成纤维细胞中富集，尤其是在FB-C2-ELN亚群中，这可能参与了心脏纤维化的调节（图4A和4B）。为了阐明优先考虑ITGA8的原因，我们详细介绍了如下分析流程：在识别出VAF中扩增的FB-C2-ELN成纤维细胞亚群后，我们对这个亚群进行了标记分析（FB-C2-ELN与其他成纤维细胞相比），然后进行了差异表达分析（VAF与供体相比）。这些结果的整合突出了ITGA8作为首要候选因子（图4C）。ITGA8和纤连蛋白（所有心脏成纤维细胞的典型标记）的共同免疫染色显示了特定的成纤维细胞亚群纤连蛋白+ITGA8+（图4D），通过snRNA-seq检测到（图4B）。此外，我们观察到VAF患者中的纤连蛋白+ITGA8+成纤维细胞数量比SR中的更多（图4D），这表明这个特定的成纤维细胞亚群可能对VAF引起的心脏纤维化有贡献，为心脏纤维化提供了潜在的治疗靶点。然而，在VAF患者和对照组之间，CD31+ITGA8+（CD31，内皮细胞标记物）、CTnT+ITGA8+（CTnT，心肌细胞标记物）以及α-SMA+ITGA8+（α-SMA，平滑肌细胞标记物）没有差异（图4D），这表明ITGA8在内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞中的表达可能不会显著影响VAF的病理过程。进一步的体外研究表明，ITGA8过表达会增强心脏成纤维细胞的增殖和迁移，并促进这些细胞产生细胞外基质（ECM），而ITGA8敲低则减少了成纤维细胞的增殖和迁移（图5A–5C），这表明ITGA8参与了心脏纤维化的调节。对ITGA8过表达的成纤维细胞进行RNA测序后发现，FB-C2-ELN的标记基因显著上调（图5D和5E）。我们的体外数据还显示，ITGA8过表达显著降低了CCL2和PLA2G2A的mRNA水平（图5B），这表明ITGA8的表达与FB-C1和FB-C5亚群中CCL2和PLA2G2A的表达呈负相关（图4B）。特别是，在ITGA8过表达的成纤维细胞中，上调的基因主要集中在TNFα信号通路、ECM受体相互作用和上皮间质转化通路，这些通路在心脏纤维化的调节中起关键作用（图5E和5F）。

**图4 心脏成纤维细胞上ITGA8的表达**
- **图例说明**：
- (A) 成纤维细胞亚群及其表达ITGA8的心脏成纤维细胞亚群的UMAP图。值得注意的是，ITGA8在FB-C2-ELN中特异性表达。
- (B) 六种成纤维细胞亚群中ITGA8的差异表达（蓝色代表健康对照组（SR），橙色代表VAF）。
- (C) FB-C2-ELN中VAF与SR之间的差异表达（y轴，log2FC [VAF vs. SR]）以及FB-C2-ELN与其他成纤维细胞亚群之间的差异表达（x轴，log2FC [FB-C2-ELN vs. 其他成纤维细胞亚群）。红色点表示log2FC (VAF vs. SR) > 0.5且log2FC (FB-C2-ELN vs. 其他成纤维细胞亚群) > 0.5，且VAF vs. SR以及FB-C2-ELN vs. 其他成纤维细胞亚群的调整后p值均<0.05。黑色点表示log2FC (VAF vs. SR) < 0.5或log2FC (FB-C2-ELN vs. 其他成纤维细胞亚群) < 0.5，或者VAF vs. SR以及FB-C2-ELN vs. 其他成纤维细胞亚群的调整后p值>0.05。
- (D) SR或VAF心脏中vimentin/ITGA8、CD31/ITGA8、α-SMA/ITGA8和CTnT/ITGA8的共免疫染色代表性图像，以及vimentin+成纤维细胞中的vimentin+ITGA8+细胞（n = 3，p = 0.0104）、CD31+内皮细胞中的CD31+ITGA8+细胞（n = 3，p = 0.8639）、α-SMA+平滑肌细胞中的α-SMA+ITGA8+细胞（n = 3，p = 0.6278）和cTnT+心肌细胞中的cTnT+ITGA8+细胞的定量。比例尺，50 μm。
- **数据说明**：
- 数据以平均值±标准误差（S.E.M）显示，比例尺为50 μm。两组之间的比较使用了t检验；本研究认为p < 0.05具有统计学意义。n.s表示无显著统计学差异。
- ?p < 0.05，***p < 0.01，****p < 0.001，********p < 0.0001。

**图5 ITGA8对心脏成纤维细胞和纤维化的功能影响**
- **图例说明**：
- (A) 通过transwell趋化试验显示ITGA8促进了心脏成纤维细胞（HCFCs）的迁移能力（n = 5；阴性对照[NC] vs. ITGA8过表达（OE）：p = 0.0003；随机对照（Scramble）vs. ITGA8 shRNA：p = 0.0438）。比例尺，200 μm。
- (B) ITGA8 NC和ITGA8 O/E细胞中PLA2G2A（n = 3，p = 0.0427）、CCL2（n = 3，p = 0.0340）和COL1A1（n = 3，p = 0.0481）的相对mRNA表达水平。
- (C) 通过MTT试验显示ITGA8促进了心脏成纤维细胞的增殖能力（n = 3；ITGA8 NC vs. ITGA8 OE在24小时：p < 0.0001；ITGA8 NC vs. ITGA8 OE在48小时：p = 0.0384；ITGA8 Scramble vs. ITGA8 shRNA在48小时：p = 0.0212）。
- **基因集富集分析（GSEA）**：
- 显示ITGA8过表达的成纤维细胞中FB-C2-ELN的标记基因上调。
- (E) ITGA8过表达的成纤维细胞中FB-C2-ELN的上调标记基因（p < 0.05）。
- (F) ITGA8过表达的成纤维细胞中上调基因富集的通路。GeneRatio表示特定通路中差异表达基因（DEGs）与该通路中总基因数的比率。颜色表示通过通路富集分析调整后的p值。NC代表阴性对照；O/E代表ITGA8过表达；Scramble代表随机对照；shRNA代表ITGA8基因沉默。
- **数据说明**：
- 数据以平均值±标准误差（S.E.M）显示。两组之间的比较使用了t检验，n.s表示无显著统计学差异。
- ?p < 0.05；***p < 0.01，****p < 0.001，********p < 0.001，********p < 0.0001。
- **研究方法**：
- 我们整合了健康对照和VAF患者的数据。

**单核细胞/巨噬细胞的亚群划分及组织修复相关基因表达的后续分析**
- 无监督聚类分析显示VAF和SR患者中存在大量巨噬细胞和树突状细胞（图6A）。我们的snRNA-seq数据发现了两种不同的巨噬细胞亚群：巨噬细胞-1（CD163和CD206）、巨噬细胞-2（MITF和GNPMB）以及单核细胞（VCAN和NAMPT）（图6A和6B）。通过单核细胞的差异表达分析发现，与SR相比，VAF样本中许多基因显著上调（ALCAM、A2M、TLR1和MSR1）和下调（VSIG4、LYVE1、FMN1和CD163）（图6C）。VAF样本中CD11b+/CD206+巨噬细胞的数量减少，而巨噬细胞-1和单核细胞的数量增加（图6D）。我们进一步对心脏组织中的CD11b和CD206进行了共免疫染色，并确认VAF样本中的CD11b+CD206+巨噬细胞减少（图6E）。通路分析显示VAF样本中多个通路上调，包括干扰素γ信号通路、移植物排斥通路和巨噬细胞亚群中的病毒性心肌炎信号通路，以及巨噬细胞-2亚群中的Rho GTP酶活性和溶酶体信号通路（图6F）。

**图6 单核细胞/巨噬细胞的亚群划分及组织修复相关基因表达的后续分析**
- **图例说明**：
- 通过单核细胞的亚群划分，我们首先对髓系细胞进行亚群划分，然后进行归一化、重新缩放、重新PCA和重新聚类。接着，我们使用VCAN、NAMPT、MITF、GNPMB、CD163和MRC1作为亚群划分的标记物。
- **显著表达的基因**：
- 颜色代表平均表达水平，点大小代表表达该标记基因的细胞百分比。
- **比例关系**：
- CD11b/CD206在SR（蓝色）和VAF（橙色）之间的差异表达。
- **数据说明**：
- 数据通过卡方检验分析（n = 2–5个生物学重复实验，每个实验包含5个技术重复）。
- 图像显示了CD11b+微镜下的CD11b+CD206+细胞数量（p < 0.0001）。比例尺，50 μm。两组之间的比较使用了t检验，********p < 0.001。
- **通路富集分析**：
- GeneRatio表示特定通路中差异表达基因（DEGs）与该通路中总基因数的比率。颜色表示通过通路富集分析调整后的p值。
- **Monocle2轨迹分析**：
- 根据假时间（pseudotime）对单核细胞/巨噬细胞进行颜色编码。比例尺，50 μm；*p < 0.05；***p < 0.01，****p < 0.001，********p < 0.0001。我们的研究整合了健康对照和VAF患者的数据。

我们使用Monocle计算了单核细胞的假时间（pseudotime）。数据显示单核细胞表现出最接近祖细胞的特征。与SR相比，VAF心脏中巨噬细胞-1亚群的数量更多，且沿着巨噬细胞轨迹具有中间水平的转录连续性。叠加的簇身份显示这些细胞属于单核细胞簇，表明它们源自单核细胞（图6G）。这些数据表明单核细胞衍生的巨噬细胞与VAF中的炎症有关。

**心肌细胞（CMs）和内皮细胞（ECs）的亚群划分**
- 通过单核细胞的差异表达分析，我们发现了788个在VAF中上调的基因（按log2倍数变化排名），包括许多上调基因（如纳利尿肽B [NPPB]、ANKRD1、TCAP、MB、ACTC等）。通过无监督聚类，我们识别出四种具有不同基因表达特征的心肌细胞亚群（图S2A）。VAF和SR样本中的心肌细胞都存在于所有4种亚群中（图S2B、S3A和S3B），并具有特定的基因表达特征（图S2C）。然而，VAF样本中的心肌细胞显示出更高的CM1和CM2标记物表达频率（例如NPPB/Matrix Gla蛋白 [MGP]/MYH7和PALLD/RNF150/PXDNL），同时显著降低了CM3和CM4标记物的表达（例如MB/COX6A2/COX7A1和KCND3/LIMCH1/PALMD/RYR2）。对每种心肌细胞状态进行的通路富集分析发现了不同的通路，包括CM1中的肥大通路、CM2中的钙信号通路、CM3中的氧化磷酸化通路和CM4中的心肌收缩通路（图S2D）。此外，我们观察到VAF中MGP和NPPB的表达总体增加（图S2E）。进一步使用熵与假时间分析，我们发现VAF心脏中表达高水平RYR2的细胞数量更多（图S3C和S3D）。我们的观察表明VAF中的心肌细胞向疾病相关的表型转变。

**VAF心脏中细胞之间的异常交叉信号传导**
- 使用CellChat比较VAF和SR样本之间的细胞-细胞通讯，发现了六个差异表达配体的信号通路。其中，THBS和FN1通路在VAF中的信息流显著增加，表明它们在VAF病理过程中可能起着关键作用（图7A）。THBS、FN1、TENASCIN、PDGF和VISFATIN通路中的配体-受体对在VAF中上调（图7B和7C）。

**图7 VAF相关细胞类型之间的细胞-细胞通讯**
- **图例说明**：
- (A) VAF和SR之间差异表达的配体-受体对的信号通路整体信息流。这些配体-受体对应在VAF的某些细胞类型中同时上调或下调（Wilcoxon秩和检验，p < 0.05）。
- (B) 由VAF相关细胞类型及其高度表达的相应配体和受体构建的细胞-细胞通讯网络。配体和受体基于在VAF中的高表达选择（调整后的p < 0.05）。
- (C) VAF和SR之间细胞亚群中编码配体和受体的基因差异表达水平。
- **数据说明**：
- 使用t检验比较两组；n.s表示无显著统计学差异。
- ?p < 0.05；***p < 0.01，****p < 0.001，********p < 0.0001。
- **研究方法**：
- 我们整合了健康对照和VAF患者的数据，以确定驱动这些通路变化的细胞来源。我们重点关注FB-C2-ELN成纤维细胞亚群——通过患者比例分析确定其在VAF中显著扩增的细胞群体。我们假设它是一个关键的信号枢纽，并验证了这一假设，发现FB-C2-ELN中特异性上调的三种配体——THBS2、PDGFD和FN1——是主要的信号来源。它们与受体细胞上的CD36、PDGFRB和整合素结合，从而增强了对关键细胞目标（包括血管内皮细胞、其他FB-C2-ELN成纤维细胞和心肌细胞）的信号传递（图7B和7C）。这一模式确认了THBS和FN1通路在VAF（心房颤动）中信息流的增加，这些通路是这种扩增的成纤维细胞群体介导的异常交叉信号传导的核心。与我们的先前发现一致，CellChat分析进一步显示ITGA8在FB-C2-ELN群体中显著上调，这突显了成纤维细胞表达的ITGA8在VAF发病机制中的重要性（图7B和7C）。ITGA8的敲低可以减少AF（心房颤动）的易感性，并改善ACh-CaCl2诱导的大鼠模型中的心房纤维化。

为了进一步验证体内ITGA8相关成纤维细胞程序的功能相关性，我们在进行ACh/CaCl2诱导的心房颤动的大鼠实验中，通过AAV（腺相关病毒）介导的小发夹RNA（shRNA）技术敲低了ITGA8的表达。在建立了心房颤动的大鼠中，我们观察到与安慰剂对照组相比，心房颤动大鼠的心房中Itga8的表达显著增加（图8A）。在AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA组中，大鼠心房中Itga8的有效敲低得到了证实（图8B）。超声心动图分析显示，与对照组相比，心房颤动组和AAV9-col1a2-NC+AF组的左心室射血分数（EF）和 fractional shortening（FS）显著降低，而AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组的EF和FS有所改善（图8B和8C）。重要的是，与对照组相比，ACh/CaCl2诱导的心房颤动模型显著增加了心房颤动的诱发率并延长了其持续时间（图8D–8F）。相比之下，AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA组显著降低了心房颤动的诱发率并缩短了其持续时间（图8D–8F）。组织学分析进一步显示，与对照组相比，心房颤动组的心房纤维化明显加剧，而在AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA组中，纤维化显著减弱（图9A–9C）。因此，与纤维化相关的基因在AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA组中显著减少（图9D）。总体而言，这些发现提供了体内证据，表明ITGA8促进心房颤动的易感性和心房纤维化重构，而ITGA8的敲低可以减轻心房颤动的脆弱性和病理性的心房重构。

图8 AAV9-col1a2-ITGA8敲降低大鼠的心房颤动易感性
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(A) 对照组和心房颤动组大鼠心房中Itga8 mRNA的相对表达水平（n = 5，p = 0.0079）。
(B) AAV9-col1a2-NC组和AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA组大鼠心房中Itga8 mRNA的相对表达水平（n = 5，p = 0.0079）。
(C) 所示组的代表性M模式超声心动图图像，显示了左心室射血分数（EF）和fractional shortening（FS）的量化，心房颤动组和AAV9-col1a2-NC+AF组的心脏功能降低，而AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA组的心脏功能改善（n = 5–7，对照组与心房颤动组相比EF：p < 0.0001，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比EF：p = 0.0002，对照组与心房颤动组相比FS：p < 0.0001，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比FS：p = 0.0004）。
(D) 每组的代表性心电图迹线，显示窦性心律或心房颤动（每个动物5次刺激，每组5只动物，对照组与心房颤动组相比p = 0.0054，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比p = 0.0023）。
(F) 每组刺激后的心房颤动持续时间（每个动物5次刺激，每组5只动物，对照组与心房颤动组相比p = 0.0362，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比p = 0.0491）。
数据以平均值±标准误差（S.E.M.）显示。卡方测试用于评估心房颤动的诱发率，单向ANOVA用于连续变量。p < 0.05被认为具有统计学意义。***p < 0.01和***p < 0.001。

图9 AAV9-col1a2-ITGA8敲降低大鼠心房颤动模型中的心房纤维化
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(A) 所示组大鼠心房的代表性H&E染色图像。
(B和C) 所示组大鼠心房的代表性Masson染色图像（B），以及心房纤维化的量化（C）（n = 5，对照组与心房颤动组相比p < 0.0001，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比p < 0.0001）。
(D) 所示组大鼠心房中与纤维化相关的基因的相对mRNA表达水平，包括Col1a1和Col3a1（n = 5，对照组与心房颤动组相比Col1a1：p < 0.0001，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比Col1a1：p = 0.0137，对照组与心房颤动组相比Col3a1：p < 0.0001，AAV9-col1a2-NC+AF组与AAV9-col1a2-ITGA8 shRNA+AF组相比Col3a1：p = 0.0002）。
数据以平均值±标准误差（S.E.M.）显示。比例尺为50 μm。单向ANOVA用于连续变量。p < 0.05被认为具有统计学意义。***p < 0.05和***p < 0.001。

讨论
cRNA-seq技术已成为生物医学研究中的一项强大工具，它使我们能够深入揭示健康和患病人体器官中细胞亚群的特征。在CAD（冠状动脉疾病）研究领域，这项技术已被越来越多地用于揭示与CAD相关的细胞亚群及其转录组的变化。在我们的研究中，我们利用单核序列分析技术来剖析健康和VAF（心房颤动）个体的心房心肌细胞。从VAF和SR（窦性心律）样本的左心房收集的37,425个细胞核中鉴定出了12种主要的心脏细胞类型。我们观察到不同细胞群体中存在不同的基因表达谱，这些表达谱与VAF有显著关联。这项技术的应用使我们能够全面解析单个心脏细胞核的基因表达谱，从而识别VAF中特定的基因表达变化。我们的发现有助于我们更好地理解VAF的分子机制，并可能为开发管理这种常见心脏心律失常的新治疗方法提供启示。

我们的研究表明，VAF患者和SR患者的心肌细胞（CMs）的转录组存在显著差异。我们鉴定了4种不同的CMs亚群，数据表明VAF患者的某些亚群中NPPB/MGP的表达上调。这些发现与当前对VAF发病机制的理解一致，并对其进行了扩展，强调了CM特异性基因调控在VAF中的重要性。长期以来，人们知道编码B型利尿肽（BNP）的NPPB是心力衰竭的生物标志物。先前的临床研究表明，BNP水平的升高是偶发性心房颤动的预测因素。这些发现表明BNP可能在心房颤动的发展和进展中起作用。与此一致，我们发现VAF患者心房中的某些CM亚群中NPPB表达上调，表明NPPB可能具有作为VAF生物标志物的潜力。MGP是我们在研究中发现的另一个有趣的目标。研究表明MGP参与动脉钙化的预防，而动脉钙化是心血管疾病发病率和死亡率的一个独立预测因子。尽管MGP在VAF中的作用尚未完全明了，但最近的证据表明，血管钙化和动脉僵硬度与心房颤动的发展密切相关。我们的结果显示，CM亚群中MGP的表达升高可能在VAF相关的心脏重构中起作用，可能影响动脉僵硬度及促进心律失常的心房结构变化。鉴于VAF与动脉僵硬度之间的已知关联，进一步研究MGP在VAF病理生理学中的作用是必要的。

本研究显示，VAF患者中的内皮细胞（ECs）总数减少，这一点通过我们的组织学观察得到了进一步证实。我们通过snRNA-seq进一步鉴定了三种主要的内皮细胞亚群，包括EC、ArtEC和VEC。我们的结果显示，VAF患者和SR患者之间EC亚群的表达谱存在显著差异。值得注意的是，我们的分析显示VAF患者的心脏ECs中富集了多种间充质特征。特别是，VIM、FN1和DCN在VAF ECs中上调，而EC标志物如PECAM、KDR和FLT1在VAF ECs中下调，这表明VAF心脏中的心脏ECs可能经历了EndMA（内皮转化成间充质）过程。这些变化表明VAF中的心脏ECs经历了EndMA，这一过程与病理性的心脏重构有关。EndMA是由缺氧和炎症环境诱导的，这在VAF中很常见，并导致内皮特性的丧失，同时促进间充质和纤维化表型的形成。已有报道指出EndMA参与病理性心脏纤维化的调节。我们的研究表明EndMA也存在于VAF引起的心脏重构过程中，这可能为VAF提供一个新的治疗靶点。

为了揭示VAF心脏中成纤维细胞的表达特征，我们对VAF患者的成纤维细胞进行了表达谱差异分析。我们的发现表明，VAF患者的成纤维细胞中与ECM相关的基因显著富集。从VAF患者获取的心脏组织样本的组织学检查证实了这些RNA测序结果，显示出心脏纤维化的显著增加。已有研究显示心脏成纤维细胞表现出高度的细胞异质性。与这些发现一致，我们的研究鉴定了六种不同的成纤维细胞亚群，包括FB-C0、FB-C1、FB-C2、FB-C3、FB-C4和FB-C5。重要的是，在VAF患者组中观察到FB-C2-ELN成纤维细胞显著富集。这些结果与最近的一项研究报道一致。此外，伪时间分析表明VAF组中的成纤维细胞表现出ECM和肌成纤维细胞相关程序的协调上调。一项关于肿瘤微环境的研究表明，ELN阳性的肌成纤维细胞是一种在正常组织中几乎不存在的肌成纤维细胞亚型，在口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织中则明显更多。他们报告称，ELN阳性的肌成纤维细胞参与鳞状细胞癌的恶性转化，并通过吸引和保留Tregs（调节性T细胞）来促进免疫抑制微环境。最近一项关于人类心脏组织的研究表明，一种与心力衰竭相关的心脏成纤维细胞亚群以ELN表达为特征，这代表了基于低熵和高伪时间值的最高分化细胞状态。与这些报道一致，我们观察到VAF特异性的ELN阳性成纤维细胞亚群FB-C2-ELN，表明ELN阳性成纤维细胞可能在器官纤维化中起重要作用。最重要的是，我们的数据表明ITGA8被确定为与VAF相关的心脏纤维化的优先候选基因。组织学分析显示VAF患者中ITGA8阳性成纤维细胞显著增加，突显了ITGA8作为评估人类心脏组织病理变化的诊断生物标志物的潜在效用。先前的研究表明ITGA8参与调节肾小球细胞中的成纤维细胞增殖和凋亡。在一项研究中，ITGA8在肝纤维化患者的样本中上调，表明这些发现与人类肝纤维化相关。另一项研究发现，ITGA8表达在肺纤维化后间质基质细胞中特别丰富，表明表达ITGA8的基质细胞调节了肺纤维化的过程。有趣的是，在压力超负荷引起的心脏重构过程中，从心脏成纤维细胞中删除Smad2/3（最重要的组织纤维化调节因子之一）会下调ITGA8的表达，这表明ITGA8可能参与心脏纤维化的调节。这些发现与我们的结果一致，表明ITGA8促进成纤维细胞的增殖、分化和迁移以及ECM的上调，表明其在VAF患者心脏纤维化中的重要作用。通过结合之前的研究结果，很明显ITGA8在多个器官系统中调节成纤维细胞功能，从而导致病理纤维化，包括VAF中的心脏纤维化。此外，我们的发现表明ITGA8可能作为调节成纤维细胞活性的潜在治疗靶点，从而解决与VAF相关的病理纤维化问题。最近的研究还发现，ITGA8在Schlemm管（SC）内皮内壁附近有丰富的表达，且ITGA8阳性细胞具有SC ECs的特性。ITGA8在心脏ECs上的表达及其潜在效应非常有趣，值得进一步研究。尽管在我们的心房snRNA-seq数据集中ITGA8在激活的成纤维细胞亚群中富集，但先前的肾脏损伤模型研究表明Itga8信号可以减轻肾小管间质纤维化，而ITga8的缺失会加剧肾纤维化，可能是通过调节TGF-β信号和成纤维细胞活化实现的。这些观察表明ITGA8的功能可能因组织和损伤模型而异。

ACh-CaCl2模型已被用于诱导大鼠的心房颤动易感性和心房重构。为了评估ITGA8相关重构程序在此模型中的功能作用，ITGA8的敲低显著降低了心房颤动的诱发率并减少了心房纤维化。这些表型效应通过将表达ITGA8的成纤维细胞与体内的心房颤动脆弱性和病理性心房重构联系起来，扩展了我们的snRNA-seq和体外观察结果。综合来看，我们的研究揭示了关于心房颤动（VAF）患者成纤维细胞组成和独特表达谱的新发现，表明成纤维细胞在VAF的病理生理学中起着重要作用。尽管我们识别并功能上研究了ITGA8富集的成纤维细胞状态，但还需要进一步的研究来完全定义下游信号传导，并确定靶向ITGA8是否能在长期或大型动物模型中改变VAF的负担。单核细胞/巨噬细胞的异质性被认为是多种心脏病理的关键调控因子，包括缺血性心脏病、心肌病、与心律失常相关的心脏重塑和心力衰竭。作为多功能免疫细胞，巨噬细胞在炎症反应和组织修复中起着重要作用，其表型和功能高度依赖于具体情境。与其他关于人类心脏的sc-RNA测序研究一致，我们的研究在VAF样本中识别出三种主要的单核细胞/巨噬细胞群体，包括单核细胞、巨噬细胞-1和巨噬细胞-2。值得注意的是，VAF患者的心脏组织中巨噬细胞亚群的数量显著减少，这表明VAF患者的心房肌层内的稳态和修复机制可能受到了干扰。

在心房颤动（AF）中，CCR2+Trem2+炎症性巨噬细胞通过分泌SPP1促进纤维化和AF的进展，这意味着巨噬细胞亚群的减少可能会导致AF的发生。事实上，我们的研究显示VAF患者中的CD11b+/CD206+巨噬细胞数量显著减少。在VAF的背景下，CD11b+/CD206+巨噬细胞亚群的减少可能会削弱炎症的消退，并通过炎症信号传导和纤维化重塑促进心律失常的形成。了解这些亚群在VAF中的平衡和功能可能会揭示新的治疗靶点。例如，旨在恢复或增强保护性巨噬细胞功能的策略可能有助于改善VAF相关的不良重塑。

**研究的局限性**
本研究存在一些局限性。首先，VAF患者来自同一队列，可能忽略了不同病因对细胞异质性和转录谱的潜在影响。此外，我们的数据集范围仅限于转录组信息，无法全面评估细胞动态。结合包含细胞表面蛋白表达和染色质可及性的补充数据集可能会使我们的发现解释更加细致。

必须承认我们在轨迹推断方面也有一些局限性。伪时间方法（包括Monocle）推断出转录相似性的低维排序，在横截面人类标本中，无法确定真正的时间动态、谱系关系或因果关系。因此，我们的伪时间结果作为假设生成的描述，值得在纵向采样、扰动研究或追踪谱系的实验模型中进行验证。

尽管存在这些局限性，我们的研究仍是对健康心脏和VAF心脏的转录组和细胞谱进行了全面的调查。我们的分析揭示了VAF过程中心脏细胞群体的变化，疾病特异性的细胞状态成为了一个明显的特征。我们的数据将为未来的研究提供宝贵的资源，并有可能推动治疗的创新和发展。

**资源可用性**
更多信息和资源请求应联系主要联系人Yongyang Zhang（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究没有生成独特的试剂。研究中使用的试剂和材料都是 commercially available 的，或可以根据合理请求从相应的作者处获得。

**数据和代码的可用性**
支持本研究的原始单核RNA测序文件已存放在NODE中，访问号为OEP00006765。由于这些人类转录组数据受中华人民共和国相关法规的管理，因此只能通过受控访问获取，不能随意公开下载。合格的研究人员可以通过NODE提交访问请求，经审核后符合条件的申请者将获得访问权限。这种受控访问安排是有效的，并非禁令或延迟发布计划。自定义分析脚本可在GitHub（https://github.com/YuliangWang316/AF_SinglecellRNAseq）和Zenodo（doi: https://doi.org/10.5281/zenodo.21816594）上获得。

**致谢**
本研究得到了国家自然科学基金（82070337, 82270395, 和 82302458）、上海市科学技术委员会（21ZR1440900）、四川大学west china医院“1+3·5学科卓越计划-临床研究孵化项目”（编号2019HXFH029）以及四川省卫生健康委员会科学技术项目（编号21PJ035）的支持。

**作者贡献**
J.W.、Y.W. 和 W.L. 分析数据并撰写了论文。Y.Z. 和 Y.Q. 设计了研究。Zhengjie Wang、J.L.、Zikun Wang、L.S.、Y.P.、Y.S. 和 L.Z. 参与了数据收集和校正。Y.Z. 和 Y.Q. 负责整体内容的监督。所有作者都参与了手稿的编写、处理和编辑。所有作者对稿件进行了重要修改，并最终批准了稿件。

**患者同意声明**
作者确认已获得本文所需的患者同意书。

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**写作过程中使用的人工智能和AI辅助技术**
AI辅助工具仅用于语言编辑和提高论文的清晰度。所有科学内容、解释和结论均由作者开发，并经过仔细审查和验证。

**关键资源表**

| REAGENT 或 RESOURCE | SOURCE | IDENTIFIER |
|-------------------|--------------------------------------------------|-------------|
| 抗体 | ITGA8 antibody | R&D Systems | Cat#MAB6194; RRID: AB_10551972 |
| Vimentin antibody | Abcam | Cat#ab8978; RRID: AB_306907 |
| CD31 antibody | Abcam | Cat#ab182981; RRID: AB_292088 |
| CD11b antibody | Abcam | Cat#ab8878; RRID: AB_306831 |
| CD206 antibody | Abcam | Cat#ab64693; RRID: AB_152391 |
| α-SMA antibody | Proteintech | Cat#14395-1-AP; RRID: AB_2223009 |
| cTnT antibody | ABclonal | Cat#A25223 |
| 细菌和病毒株 | AAV9 vector | Hanbio Biotechnology | HBAAV-col1a2-Zs |
| 生物样本 | Human left atrial appendage tissues from VAF patients and sinus rhythm donors | West China Hospital | |
| 化学品、肽和重组蛋白 | DBSP | Therm Fisher | Cat#14190144 |
| DMEM | Corning | Cat#10-013-CV |
| 胎牛血清 | Gemini | Cat#900-108 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | Cat#P4333 |
| TRIzol | Invitrogen | Cat#155960 |
| CNP | Sigma | Cat#TR-100 |
| Puromycin | Beyotime | Cat#ST551-50 mg |
| 4%福尔马林 | Servicebio | Cat#G1101 |
| 核分离试剂盒 | SHBIO | Cat#52009-10 |
| Chromium Single Cell 3′ Library and Gel Bead Kit | 10x Genomics | Cat#CG000204 |
| 慢病毒浓缩试剂盒 | Genomeditech | Cat#GM-04080 |

**存档数据**
单核RNA测序数据集：NODE OEP00006765；https://www.biosino.org/node/project/detail/OEP00006765

**分析脚本**
GitHub：https://github.com/YuliangWang316/AF_SinglecellRNAseq

**实验模型：**
细胞系：Human cardiac fibroblast cells (HCFCs)（BLUEFBIO，Cat#YS-01X7593）；HEK293T细胞（American Type Culture Collection，Cat#CRL-1573）

**实验模型：**
生物体/菌株：大鼠：Sprague-Dawley大鼠（Scientific Research Platform of Shanghai Chest Hospital，Cat#R-SD-01）

**寡核苷酸：**
ITGA8 shRNA目标序列：5′-CCAGATAAGCAGGAGATAATT-3′

**重组DNA：**
AAV9-Col1a2-ITGA8 shRNA（Hanbio Biotechnology，Cat#111012910）
AAV9-Col1a2-NC对照载体（Hanbio Biotechnology，Cat#111012909）

**软件和算法：**
Cell Ranger v3.0 (10x Genomics, https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger)
Seurat v3.0.2 (Satija等，https://satijalab.org/seurat/Harmony)
Harmony (Korsunsky等，https://github.com/immunogenomics/harmony)
STAR aligner (Dobin等，https://github.com/alexdobin/STAR)
Monocle v2.20.0 (Trapnell实验室，http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/)
CellChat v1.6.1 (Jin等，https://github.com/sqjin/CellChat)
clusterProfiler (Yu等，https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler)
Msigdbr (MSigDB/R package，https://igordot.github.io/msigdbr/)
DESeq2 (Bioconductor，https://bioconductor.org/packages/DESeq2)

**其他：**
小麦胚芽凝集素（WGA）（Invitrogen，Cat#W11261）
Masson染色试剂盒（Yeasen Biotechnology，Cat#60532）
Chromium Single Cell Processor（10x Genomics）
N/AMinaSeq 6000测序系统（Illumina）
Mindray Z60超声心动图系统（Mindray，Cat#211397）
BL-420N生物信号采集系统（Chengdu Taimeng Technology）
经食道起搏电极（N/A）

**样本准备和单核RNA测序**
从三名接受二尖瓣置换术、迷宫消融和左心耳切除术的持续性风湿性瓣膜性心房颤动（VAF）患者中收集左心耳组织。作为对比，还从同一区域的3名窦性心律（SR）受者和3名VAF患者中收集了健康捐赠者的左心耳组织，这些健康捐赠者按年龄和性别匹配。这些健康样本是从同种异体库中获得的，因临床用途被拒绝而用于研究。健康捐赠者被拒绝移植的临床标准包括配对失败或受者已被评估为不适合移植。该研究获得了四川大学West China医院伦理委员会的批准（批准编号2018301）。

**动物模型**
使用250–300克的Sprague-Dawley雄性大鼠。动物被随机分配到对照组、AF组、AF + AAV9-Col1a2-NC组和AF + AAV9-Col1a2-ITGA8 shRNA组。动物实验获得了上海交通大学动物伦理委员会的批准（KS26044）。

**方法细节**
1. **样本准备和单核RNA测序**：组织用DPBS清洗，冰上粉碎，使用SHBIO Nuclei Isolation Kit分离细胞核。使用Chromium Single Cell 3′ Library and Gel Bead Kit v3（10x Genomics）生成文库，通过Chromium Single Cell Processor处理，并使用Illumina NovaSeq 6000进行测序。
2. **读取对齐和转录组处理**：FASTQ文件使用Cell Ranger v3.0.1处理。读取结果使用STAR对齐到人类GRCh38基因组。基因条形码矩阵使用Seurat v3.0.2和Harmony进行整合。
3. **细胞聚类和注释**：使用PCA和UMAP进行维度缩减。使用已建立的标记基因对细胞簇进行注释。
4. **差异表达分析**：使用Seurat、DESeq2和伪批量方法进行差异表达分析。
5. **通路富集分析**：基于MSigDB基因集，使用clusterProfiler和msigdbr进行通路富集分析。
6. **轨迹分析**：使用Monocle v2.20.0和DDRTree进行轨迹推断。
7. **细胞-细胞通信分析**：使用CellChat v1.6.1进行细胞-细胞通信分析。
8. **组织和免疫染色**：人类和大鼠心脏组织经过H&E染色、Masson三色染色、WGA染色，以及使用针对ITGA8、Vimentin、CD31、CD11b、CD206、α-SMA和cTnT的抗体的免疫染色。
9. **细胞培养和迁移实验**：人类心脏成纤维细胞在含有胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM中培养。迁移使用Boyden chamber实验检测。
10. **慢病毒基因操作**：使用pCMV.DR8和pMD2.G包装质粒在HEK293T细胞中生成慢病毒载体。细胞在polybrene存在下感染，并使用puromycin筛选。
11. **AAV介导的ITGA8下调**：从Hanbio Biotechnology获得携带Col1a2启动子驱动的ITGA8 shRNA或对照序列的AAV9载体，通过尾静脉注射给予。
12. **超声心动图和电生理学**：使用Mindray Z60超声心动图评估心脏功能。使用经食道起搏和BL-420N生物信号采集系统评估AF的诱发能力。
13. **RT-qPCR**：使用TRIzol提取RNA。cDNA合成和qPCR使用SuperScript First Strand Synthesis System、PowerUp SYBR Green Master Mix和QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System进行。

**量化及统计分析**
数据以均值±SEM表示。统计测试和生物重复次数在图例中注明。两组比较使用配对双尾 Student’s t检验。多组比较使用带Tukey校正的单因素ANOVA。AF诱导能力使用卡方检验或Fisher精确检验分析。统计显著性定义为?p < 0.05；??p < 0.01；??p < 0.001；???p < 0.0001；ns表示无显著性。

**其他**
本研究在中国临床试验注册处注册，注册号为ChiCTR1800019870。

**补充信息（1）**
PDF文件（1.60 MB）：文档S1。图S1–S4