《Diagnostics》：Mechanisms Underlying Negative p53 Immunocytochemistry in Oral Cytology: TP53 mRNA Expression and Sampling Limitations
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背景：补充细胞形态学评估以早期识别高风险口腔上皮病变的可靠分子生物标志物仍然有限。尽管p53免疫细胞化学（ICC）被用作TP53异常的替代标志物，但p53蛋白表达并不总能反映TP53转录活性。本研究探讨了在口腔高级别鳞状上皮内病变（OHSIL）和口腔鳞状细胞癌
背景：补充细胞形态学评估以早期识别高风险口腔上皮病变的可靠分子生物标志物仍然有限。尽管p53免疫细胞化学（ICC）被用作TP53异常的替代标志物，但p53蛋白表达并不总能反映TP53转录活性。本研究探讨了在口腔高级别鳞状上皮内病变（OHSIL）和口腔鳞状细胞癌（SCC）类别中，p53 ICC、TP53 mRNA表达和p53免疫组织化学（IHC）染色模式之间的关系。方法：根据口腔细胞学报告Bethesda系统，将504例液基细胞学（LBC）标本分类为：上皮内病变或恶性肿瘤阴性（NILM）（n=394）、口腔低级别鳞状上皮内病变（OLSIL）（n=72）、OHSIL（n=18）和SCC（n=20）。对细胞学标本进行p53 ICC，使用残余LBC样本通过定量实时PCR定量TP53 mRNA表达，并评估相应活检标本的p53 IHC染色模式。还分析了p53 ICC与临床病理变量之间的关联。结果：p53标记指数随细胞学严重程度显著增加，OHSIL和SCC中的TP53 mRNA表达显著高于NILM和OLSIL。在OHSIL和SCC中，显示null型p53 IHC染色模式的病变其TP53 mRNA表达显著低于非null染色模式的病变。在OHSIL中，p53 ICC与临床病理变量之间未观察到显著关联。相反，SCC中p53 ICC阳性与肿瘤大小、浸润深度和p53 IHC染色模式显著相关。结论：p53 ICC阴性可能源于采样局限性或null型TP53表达。TP53 mRNA分析提供了补充性分子信息，可区分由采样局限性引起的假阴性p53 ICC与生物学上降低的TP53表达。整合细胞形态学、p53 ICC、组织病理学和TP53 mRNA分析可能提高高风险口腔上皮病变的诊断准确性和风险分层。
论文解读：口腔鳞状细胞癌（SCC）是头颈部常见的恶性肿瘤，常由口腔潜在恶性疾患（OPMDs），包括口腔上皮异常增生（OED）进展而来。患者的预后与诊断时的分期密切相关，因此早期识别高风险病变是重要的临床挑战。为改善口腔细胞学的标准化和诊断准确性，日本临床细胞学会于2015年发布了国内诊断指南，并于2022年引入了基于Bethesda系统的报告框架，建立了包括口腔低级别鳞状上皮内病变（OLSIL）和口腔高级别鳞状上皮内病变（OHSIL）在内的标准化诊断类别，并推荐采用液基细胞学（LBC）进行标本制备。然而，能够补充细胞形态学评估并准确识别高风险口腔上皮病变的可靠分子生物标志物仍然有限。在日常实践中，仅依据细胞形态学特征区分反应性上皮非典型增生与OHSIL或早期SCC存在困难。p53是评估口腔上皮病变中应用最广泛且临床接受的标志物之一。TP53是头颈部鳞状细胞癌中最常发生改变的抑癌基因，其改变是口腔癌发生过程中的早期事件。p53免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）常作为评估TP53异常的替代方法，但p53蛋白表达并不总能反映TP53转录活性。特别是，显示null型免疫染色模式的病变可能在检测不到p53蛋白的情况下仍保留TP53 mRNA表达，而另一些病变则完全缺乏TP53 mRNA和p53蛋白表达。此外，脱落口腔细胞学固有权衡于采样局限性，因为基因改变的细胞可能局限于基底和副基底层。因此，单独使用p53 ICC可能会低估与高风险口腔上皮病变相关的分子异常。定量实时PCR（qRT-PCR）的进展使得对临床标本中TP53 mRNA表达进行高灵敏度定量评估成为可能。该研究旨在探讨在根据Bethesda系统诊断的OHSIL和SCC类别中，p53 ICC表达、TP53 mRNA表达和p53 IHC染色模式之间的关系，以阐明p53-null病变的生物学特征，并确定口腔细胞学中p53 ICC阴性的两种主要机制。该研究回顾性收集了新潟大学医学牙科医院2023年1月至2026年4月期间的口腔LBC标本，共504例，包括NILM 394例、OLSIL 72例、OHSIL 18例和SCC 20例。研究人员发现，p53标记指数随细胞学严重程度显著增加，TP53 mRNA表达在OHSIL和SCC中显著高于NILM和OLSIL。在OHSIL和SCC中，显示null型p53 IHC染色模式的病变其TP53 mRNA表达显著低于非null型。在SCC中，p53 ICC阳性与肿瘤大小、浸润深度和p53 IHC染色模式显著相关，而OHSIL中无显著关联。结论认为，p53 ICC阴性可能源于采样局限性或null型TP53表达，整合细胞形态学、p53 ICC、组织病理学和TP53 mRNA分析可能提高高风险口腔上皮病变的诊断准确性和风险分层。该论文发表在《Diagnostics》。
研究人员开展研究时主要采用了以下关键方法：研究样本来自新潟大学医学牙科医院2023年1月至2026年4月的口腔LBC标本，共504例（NILM 394例，OLSIL 72例，OHSIL 18例，SCC 20例），其中154例有相应活检标本。采用SurePath液基细胞学系统制备细胞学标本，使用抗p53单克隆抗体（克隆DO-7）进行p53免疫细胞化学（ICC），计算p53标记指数（LI）。对活检标本进行p53免疫组织化学（IHC），根据Sawada等提出的标准将染色模式分为正常（NM）、基底/副基底（BP）、高表达（HI）和缺失（LS）四类。使用RNAqueous试剂盒从残余LBC样本中提取总RNA，通过TaqMan探针进行qRT-PCR定量TP53 mRNA表达（以18S rRNA为内参，采用2
?ΔΔCt法）。使用EZR软件进行统计学分析，包括单因素方差分析、Tukey多重比较检验和Fisher精确检验。
研究结果部分如下：
3.1 临床病理特征：共收集510例LBC标本，排除6例不满意标本，剩余504例。其中NILM 394例、OLSIL 72例、OHSIL 18例、SCC 20例。在18例OHSIL中，组织学诊断包括SCC 11例（61.1%）、重度OED或原位癌（CIS）6例（33.3%）、中度OED 1例（5.6%）；在20例SCC中，16例（80.0%）组织学确认为SCC，4例（20.0%）为重度OED/CIS。NILM和OLSIL中未检出p53 ICC阳性病例，OHSIL中2/18（11.1%）阳性，SCC中13/20（65.0%）阳性。
3.2 p53 ICC在口腔上皮病变中的表达：p53标记指数随细胞学严重程度升高而逐渐增加，OHSIL和SCC中p53阳性病例比例和平均p53 LI均显著高于NILM和OLSIL。在OHSIL和SCC中，显示null型p53 IHC染色模式的病例其p53 LI显著低于非null型。这表明null型病变在细胞学标本中p53蛋白表达显著降低或缺失。
3.3 根据是否存在null型p53 IHC染色模式的TP53 mRNA表达：TP53 mRNA相对表达随细胞学严重程度增加而升高，OHSIL和SCC显著高于NILM和OLSIL。在OHSIL和SCC中，null型p53 IHC染色模式病变的TP53 mRNA表达显著低于非null型。这表明null型p53 IHC染色模式与TP53转录减少相关。
3.4 代表性p53 IHC染色模式：展示了四种模式的细胞学、组织学、ICC和IHC代表性图像。NM和BP模式显示p53阳性细胞局限于基底/副基底层，HI模式显示弥漫性染色延伸至基底上层，而LS（即null型）模式显示上皮结构保留但p53免疫反应完全缺失。研究提出了解释p53 ICC阴性的两种机制：采样局限性（异常细胞未被捕获）和null型p53表达（异常细胞被捕获但p53蛋白表达缺失或显著减少）。
3.5 p53 ICC表达与临床病理因素的关系：在OHSIL患者（n=18）中，p53 ICC阳性与肿瘤大小（p=0.497）和浸润深度（p=0.497）均无显著关联。相反，在SCC患者（n=20）中，p53 ICC阳性与肿瘤大小≥20 mm（91.7% vs 25.0%，p=0.004）、更深的浸润深度（p=0.031）及p53 IHC染色模式（p<0.001）显著相关。
讨论部分总结指出，p53 ICC阴性不应被视为单一机制，而应区分为采样局限性和null型p53表达两种生物学上不同的机制。在OHSIL中，TP53异常细胞常局限于基底和副基底上皮层，难以被脱落细胞学获取，导致假阴性结果。随着病变进展为SCC，异常细胞群体扩增，p53 ICC敏感性提高，这解释了SCC中p53 ICC阳性与肿瘤大小、浸润深度和p53 IHC模式的显著关联。因此，p53 ICC阴性结果不应排除活检，应结合细胞形态学、组织病理学和TP53 mRNA分析进行综合判断。研究局限性包括OHSIL样本量较小、仅检测TP53 mRNA、以及RNA完整性未直接评估。结论部分翻译：阴性p53免疫细胞化学是两种不同机制的结果：采样局限性和null型p53表达。因此，阴性p53 ICC不应被解释为不存在高风险口腔上皮病变的证据。整合细胞形态学、p53 ICC、组织病理学和TP53 mRNA分析可能提高诊断准确性并减少假阴性解释。这些发现为在口腔上皮病变细胞学评估中解释阴性p53 ICC提供了实用框架。
