2-吡喃酮-4,6-二甲酸的工程化谷氨酸棒状杆菌细胞工厂生物制造

《Fermentation》：Biomanufacturing of 2-Pyrone-4,6-dicarboxylic Acid by an Engineered Corynebacterium glutamicum Cell Factory

　　

2-吡喃酮-4,6-二甲酸（PDC）是一种具有前景的伪芳香族生物基单体，可用于生产可生物降解聚酯。在本研究中，研究人员将代谢工程与发酵工艺优化相结合，在谷氨酸棒状杆菌（*Corynebacterium glutamicum*）中建立了高效的PDC从头生物合成途径。为增强PDC直接前体原生质酸（PCA）的可及性，研究人员阻断了内源PCA降解途径，并强化了莽草酸途径的前体供应。随后，研究人员异源引入了来自 *Sphingomonas paucimobilis* SYK-6 的 *ligABC* 基因簇，以实现从葡萄糖合成PDC。培养基筛选确定了一种含玉米浆的配方，在摇瓶培养中将PDC效价提高了1.4倍。在5-L生物反应器中，进一步优化玉米浆浓度、溶解氧和葡萄糖补料速率，在90 h时将PDC效价提升至71.1 g/L，平均生产率为0.8 g/L/h，这是迄今为止报道的谷氨酸棒状杆菌基PDC生产中的最高生产率。

**论文解读：工程化谷氨酸棒状杆菌高效生物合成2-吡喃酮-4,6-二甲酸的研究**

**研究背景与意义**
开发生物基聚合物单体是减少对化石资源依赖、拓展可持续材料种类的重要策略。在众多生物基单体中，2-吡喃酮-4,6-二甲酸（PDC）因其与石油基单体对苯二甲酸（TPA）结构相似的伪芳香环骨架而备受关注。PDC分子含有两个羧基和一个共轭吡喃酮环，可与二醇聚合生成具有熔融可加工性、弹性、粘附性及生物降解性的聚酯，是极具潜力的可持续聚合物砌块。然而，现有生物法PDC生产仍面临前体供应不足和发酵工艺优化欠缺等瓶颈。虽然以大肠杆菌（*Escherichia coli*）为宿主的研究已实现较高PDC产量，但其胞内PCA供应限制仍制约了生产效能的进一步提升。谷氨酸棒状杆菌（*Corynebacterium glutamicum*）作为公认安全（GRAS）的工业生产菌株，天然具备PCA生物合成途径，为PDC生产提供了独特优势。然而，此前基于该菌株的研究采用DHS与分支酸双前体策略，代谢途径复杂且存在碳通量竞争。相比之下，单一DHS途径更为简洁高效。此外，针对PDC生产的系统发酵工艺优化研究仍较为缺乏。因此，本研究旨在通过代谢工程与发酵优化相结合的策略，构建高效的谷氨酸棒状杆菌PDC细胞工厂。

**研究内容与结论**
研究人员首先通过阻断内源竞争途径增强PCA积累。敲除编码PCA 3,4-双加氧酶的*pcaHG*基因簇，阻断了β-酮己二酸途径对PCA的降解，使PCA摇瓶产量达1.6 g/L。进一步敲除*aroE*基因以消除DHS向莽草酸的分流，PCA产量提升至2.8 g/L。随后过表达编码DHS脱水酶的*qsuB*基因强化DHS向PCA的转化，产量提高至4.5 g/L。在此基础上，过表达抗反馈抑制的DAHP合酶变体基因*aroG^S180F*，增强莽草酸途径碳通量，最终使PCA产量达到7.2 g/L。将来源于 *Sphingomonas paucimobilis* SYK-6 的*ligABC*基因簇异源导入上述底盘菌株，成功构建了从葡萄糖从头合成PDC的工程菌株Cg2-03，摇瓶水平PDC产量达6.5 g/L。在培养基筛选方面，研究人员比较了四种不同培养基，发现含玉米浆的Medium 1培养基最有利于PDC合成，产量提升至9.4 g/L。在5-L生物反应器中进行补料分批发酵优化，依次考察了玉米浆浓度、溶解氧（DO）和葡萄糖补料速率的影响。结果表明，20 g/L玉米浆为最优浓度，PDC产量为54.2 g/L；30% DO为最优氧供给条件，产量提升至64.6 g/L；4 g/L/h的葡萄糖补料速率最为适宜，最终在90 h时获得71.1 g/L的PDC，平均生产率为0.8 g/L/h，这是目前谷氨酸棒状杆菌基PDC生产中的最高报道值。

**关键技术与方法**
本研究采用了以下主要技术方法：（1）CRISPR-Cpf1辅助基因组编辑系统用于谷氨酸棒状杆菌的基因敲除；（2）基于同源重组的质粒构建技术（ClonExpress II One Step Cloning Kit）用于基因过表达；（3）异源表达来源于 *S. paucimobilis* SYK-6 的*ligABC*基因簇以实现PDC生物合成；（4）高效液相色谱（HPLC）法对葡萄糖、PCA和PDC进行定量分析；（5）5-L生物反应器补料分批发酵工艺优化。研究使用的亲本菌株为 *C. glutamicum* ATCC 13032。

**研究结果**
**3.1 谷氨酸棒状杆菌中PDC从头生物合成途径的构建**
通过在野生型谷氨酸棒状杆菌中依次敲除*pcaHG*和*aroE*、过表达*qsuB*和*aroG^S180F*，逐步构建了高效PCA生产底盘菌株Cg2-02，PCA产量达7.2 g/L。在此基础上异源表达*ligABC*基因簇获得菌株Cg2-03，成功实现了从葡萄糖从头合成PDC，72 h摇瓶培养PDC产量为6.5 g/L，并经LC-MS分析确认产物结构。

**3.2 摇瓶水平发酵培养基筛选**
在CGXII、Medium 1、Medium 2和Medium 3四种培养基中培养菌株Cg2-03，比较其PDC合成能力。结果表明，含玉米浆的Medium 1效果最佳，PDC产量为9.4 g/L，较初始培养基显著提高。含酵母提取物的Medium 2次之（7.8 g/L），而CGXII和Medium 3产量均低于7.0 g/L。有机氮源的补充是提高PDC产量的关键因素，因此选择Medium 1作为后续优化培养基。

**3.3 5-L生物反应器中PDC补料分批发酵优化**
**3.3.1 玉米浆浓度对PDC发酵的影响**
考察了10、15、20和30 g/L四种初始玉米浆浓度。随着玉米浆浓度从10 g/L提高到20 g/L，PDC产量从46.7 g/L逐步提升至最大值54.2 g/L。但进一步提高至30 g/L时产量略降至52.3 g/L，表明20 g/L为最优玉米浆添加量。

**3.3.2 溶解氧供应对PDC生物合成的影响**
在20%、30%和35%三个DO水平下进行发酵。将DO从20%提升至30%后，残余PCA显著减少，PDC产量从54.2 g/L提高至64.6 g/L，产率从0.5 g/L/h提升至0.7 g/L/h。但DO继续升高至35%时，PDC产量反而下降至59.8 g/L，可能由于氧化应激导致碳流转向维持代谢。因此选择30% DO为最优条件。

**3.3.3 葡萄糖补料速率对PDC效价提升的优化**
在最优玉米浆浓度和DO条件下，比较了2、4和6 g/L/h三种葡萄糖补料速率。采用4 g/L/h补料速率时，菌株Cg2-03在90 h获得最高PDC产量71.1 g/L，体积生产率为0.8 g/L/h，产率为0.31 g/g。进一步提高至6 g/L/h反而使产量下降至62.7 g/L，过量的碳流被导向生物量积累而非产物合成。因此4 g/L/h为最优葡萄糖补料速率。

**讨论与结论**
讨论部分指出，通过代谢工程与发酵优化的协同策略，本研究成功构建了高效的谷氨酸棒状杆菌PDC细胞工厂。与先前采用DHS和分支酸双前体策略的研究相比，本研究所采用的单一DHS途径所需遗传操作更为简洁，且摇瓶产量相当，凸显了该途径的高效性。此外，玉米浆作为经济有效的有机氮源，其浓度优化对PDC产量的提升具有关键作用。DO优化与LigAB酶依赖分子氧的催化特性相一致，进一步促进了PCA向PDC的高效转化。葡萄糖补料速率的研究及分阶段动力学分析表明，PDC合成以生长偶联型为主，生长阶段贡献了总产量的66.6%–89.3%。在最优条件下，工程菌株实现71.1 g/L PDC产量和0.8 g/L/h的生产率，超越了此前报道的谷氨酸棒状杆菌基PDC生产水平，为工业化规模的PDC生物制造提供了有前景的平台。研究结论部分指出，通过代谢工程与发酵优化的协同调控，本研究成功建立了高效的谷氨酸棒状杆菌PDC从头合成细胞工厂，为规模化PDC生物制造奠定了坚实基础。