龙舌兰属物种影响传统Pulque接种物微生物组的分类学及预测功能结构

《Fermentation》：Agave Species Influence the Taxonomic and Predicted Functional Structure of Traditional Pulque Inoculum Microbiomes

　　

Pulque是一种传统墨西哥饮料，通过数种龙舌兰属（Agave）植物的汁液“aguamiel”的自发发酵生产。发酵依靠添加先前发酵的接种物（当地称为“semilla”），其微生物群落对该饮料的感官和理化特性有所贡献。本研究的目的是利用鸟枪法宏基因组测序，对由Agave mapisaga和Agave salmiana制备的Pulque接种物的微生物分类组成和功能潜力进行初步表征。在DNBSEQ平台上对6个接种物样本进行150 bp双端测序。采用基于CTAB的裂解方案提取宏基因组DNA，并在Galaxy平台进行分析。分析流程包括质量过滤、宿主序列去除、使用Kraken2进行分类学分类、使用MEGAHIT进行组装，以及使用eggNOG Mapper进行功能注释。来自A. mapisaga和A. salmiana汁液的接种物中的细菌群落以醋杆菌属（Acetobacter）（68.1%和58.3%）和明串珠菌属（Leuconostoc）（19.5%和21.9%）为主。Komagataeibacter在A. mapisaga接种物中更丰富（3.8%），而发酵单胞菌属（Zymomonas）在A. salmiana接种物中更丰富（11.7%）。物种水平上的最大差异体现在运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis），其在A. salmiana中的平均相对丰度高6.4倍。真菌群落分别以酵母属（Saccharomyces）（91.4%和72.7%）和克鲁维酵母属（Kluyveromyces）（6.6%和25.5%）为主。在所有重复中，最丰富的物种是Acetobacter sp. AC2005（23.9%）、Saccharomyces paradoxus（17.0%）和Zymomonas mobilis（12.9%），合计占总相对丰度的约54%。马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）在A. salmiana接种物中丰度高3.9倍，而Saccharomyces paradoxus在A. mapisaga接种物中高1.26倍。Alpha多样性分析显示，A. mapisaga接种物中细菌多样性较高，Shannon指数为2.74，并有35个特有物种；而A. salmiana接种物表现出更高的真菌多样性，Shannon指数为0.68。这些差异没有统计学意义（p > 0.05）。然而，Beta多样性分析提示，两种龙舌兰物种相关的微生物群落之间存在明显的分离（R² ≈ 0.92）。功能注释鉴定了可能与碳水化合物代谢、蔗糖降解和次生代谢产物生物合成相关的基因。这些发现表明，作为汁液来源的龙舌兰物种可能影响参与Pulque发酵的微生物群落的分类组成和功能潜力。

Pulque是一种传统墨西哥发酵饮料，由龙舌兰属（Agave）植物的汁液“aguamiel”自然发酵而成。发酵过程依靠被称为“semilla”的预先发酵接种物，其微生物群落以乳酸菌、醋酸菌和酵母为主，赋予饮品特有的感官和理化品质。不同龙舌兰物种的汁液成分存在差异，可能导致接种物微生物组的结构和功能发生改变。然而，以往研究多依赖培养法或靶向16S rRNA/ITS测序，难以全面反映微生物多样性及其代谢功能。鸟枪法宏基因组测序可直接分析样本中全部微生物DNA，同时获得分类组成和功能基因信息。为此，研究人员以Agave mapisaga和Agave salmiana两种龙舌兰制备的Pulque接种物为对象，利用鸟枪法宏基因组测序开展初步表征，探讨龙舌兰物种是否影响接种物微生物组的分类学和预测功能结构。该研究发表于《Fermentation》期刊。

在关键技术方法上，研究人员在墨西哥州特莫亚（Temoaya, State of Mexico）采集传统生产者栽培的A. mapisaga（BTR）和A. salmiana（VTR）龙舌兰汁液，每种制备3个生物学重复的接种物，共6个样本。采用基于CTAB的方案提取宏基因组DNA，在DNBSEQ平台进行150 bp双端测序。生物信息分析基于Galaxy平台，使用fastp质控、Bowtie2去除人源和龙舌兰宿主序列、Kraken2分类、MEGAHIT组装、Prokka基因预测及eggNOG功能注释；多样性统计在Kosmos Edison平台完成，使用Shannon/Simpson/Chao1指数、Bray–Curtis距离及PERMANOVA检验；差异丰度分析采用log2转换后的Welch t检验并经过Benjamini–Hochberg校正。

### 3.1 接种物的分类学组成

宏基因组分析显示，两种接种物的微生物群落均以细菌和真菌为主，病毒及其他真核生物相对丰度低。属水平上，细菌主要由醋杆菌属（Acetobacter）和明串珠菌属（Leuconostoc）主导；A. mapisaga接种物中Acetobacter占68.1%、Leuconostoc占19.5%，A. salmiana中分别为58.3%和21.9%。真菌以酵母属（Saccharomyces）和克鲁维酵母属（Kluyveromyces）为主，A. mapisaga中Saccharomyces占91.4%、Kluyveromyces占6.6%，A. salmiana中分别为72.7%和25.5%。在物种水平上，最丰富的物种是Acetobacter sp. AC2005（23.9%）、Saccharomyces paradoxus（17.0%）和运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）（12.9%），三者合计约占总相对丰度的54%。差异分析显示，Zymomonas mobilis在A. salmiana中的平均相对丰度约为A. mapisaga的6.4倍；马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）在A. salmiana中高3.9倍，而Saccharomyces paradoxus在A. mapisaga中约高1.26倍。此外，白色念珠菌（Candida albicans）仅在A. salmiana中检出，相对丰度为1.19%–1.69%。经log2转换后的Welch t检验及FDR校正，共有8种细菌和3种真菌在两类接种物间存在显著差异（q < 0.05），病毒分类群则无显著差异。

### 3.2 多样性分析

Alpha多样性在两类接种物之间未发现显著差异（p > 0.05），但A. salmiana接种物呈现较高的真菌多样性趋势，其真菌Shannon指数约为0.639，而A. mapisaga为0.303；Simpson指数分别为0.396和0.143。Beta多样性采用Bray–Curtis距离和PERMANOVA检验，也未检出统计学显著差异，但真菌群落显示出最强的组间分离趋势（R² = 0.938，p = 0.094），总微生物群落的R² = 0.917，细菌群落的R² = 0.879，病毒群落几乎没有异质性（R² = 0.005）。PERMDISP检验未发现组内离散度显著不同，说明上述PERMANOVA结果并未受到组间变异不均衡的混淆。

### 3.3 宏基因组功能注释

功能注释发现，接种物宏基因组中包含多种碳水化合物活性酶（CAZy）家族，主要有糖基转移酶（GTs）、糖苷水解酶（GHs）、碳水化合物酯酶（CEs）和碳水化合物结合模块（CBMs），这些酶可能参与多糖转化和糖类利用。COG功能分类显示两类接种物存在差异：A. salmiana接种物中与DNA复制、重组和修复（L类）及细胞壁/膜/包膜生物合成（M类）相关的基因相对丰度较高；A. mapisaga接种物则富集RNA加工和修饰（A类）、染色质结构和动力学（B类）以及转录（K类）相关基因。KEGG直系同源（KO）注释进一步显示，A. mapisaga接种物富集ABC转运蛋白（K06147、K02004、K01537）等与营养物转运、能量代谢和代谢调控相关的基因；A. salmiana接种物则富集应激反应和DNA修复（K03701）、蛋白质合成（K02994、K02337）以及碳水化合物代谢（K01153、K01992）相关基因。这些预测功能差异可能反映两组中优势微生物类群的不同，但尚需转录组、蛋白组或生化实验验证。

在讨论部分，研究人员总结了本研究的意义和局限。高丰度的Acetobacter可能由于接种物采集时已进入醋酸发酵阶段，适宜醋酸菌的氧化代谢；Leuconostoc可能参与异型乳酸发酵和胞外多糖产生，与Pulque的黏度有关。Zymomonas mobilis是Pulque发酵中常见的产乙醇菌，通过Entner–Doudoroff途径适应高糖环境。不同龙舌兰物种可能通过汁液组成差异塑造独特的微生物生态位，但本研究的生物学重复数有限，尚不能明确归因于龙舌兰物种。未来需要增加龙舌兰物种、产地、发酵阶段和生产者来源，并整合宏转录组、代谢组和生化验证，以确证预测功能并评估潜在益生特性。

研究结论部分可概括为：鸟枪法宏基因组测序显示，由A. mapisaga和A. salmiana制备的Pulque接种物含有以发酵性细菌和酵母为主的复杂微生物群落，主要包括Acetobacter、Leuconostoc、Zymomonas、Saccharomyces和Kluyveromyces。尽管alpha和beta多样性指标在两类接种物间没有显著差异，但在分类学组成以及与碳水化合物代谢、细胞修复和应激反应相关的预测功能方面观察到了探索性差异。