干扰DNA修复途径以增强螯肢类动物遗传模型中CRISPR-Cas9介导的同源定向修复

《iScience》：Interfering with DNA repair pathways to enhance CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair in a chelicerate genetic model

　　亮点
- 研究了二倍体断裂（DSBs）在Tetranychus urticae中的DNA修复
- 卵细胞中DSBs的末端连接主要由theta介导的末端连接驱动
- DNA聚合酶θ（Pol θ）的缺失使DSB修复转向同源定向修复
- Polθ缺陷的螨虫品系提高了基于CRISPR的基因敲入效率

摘要
二斑叶螨（Tetranychus urticae）是一种主要的害虫，同时也是一个新兴的遗传模型。最近的CRISPR-Cas9技术进步，特别是SYNCAS方法（用于母系传递Cas9核糖核蛋白），使得在这一及其他难以转化的节肢动物中进行精确的基因组编辑成为可能。然而，SYNCAS介导的基因敲入效率存在差异，这可能是由于DNA修复途径之间的竞争所致，而这些途径在T. urticae和其他螯肢动物中的机制尚不明确。在这里，我们首次对螯肢动物的二倍体断裂修复进行了功能分析。DNA聚合酶θ（Polθ）的缺失几乎完全使修复过程转向同源定向修复，而Ligase IV的缺失则没有可检测到的影响。通过使用针对植烯脱饱和酶的报告基因检测，我们证明了Polθ缺陷品系能够增强修复模板的整合，即使突变点距离切割位点较远。此外，较大片段的插入也得到了改善。最后，破坏Polθ仅带来轻微的适应度成本，这突显了其在未来该物种基因组工程中的价值。

图形摘要

引言
二倍体断裂（DSBs）是最严重的DNA损伤形式之一，如果不能准确修复，可能会危及基因组的完整性并威胁细胞存活。这些断裂可能在内源过程中（如DNA复制和减数重组）产生，或在外源因素（如电离辐射、化疗药物和氧化应激）的作用下形成。此外，还可以利用CRISPR-Cas系统等基因编辑工具有意引入DSBs，以特定方式修改基因。哺乳动物细胞使用四种主要的修复途径来处理DNA中的DSB损伤：非同源末端连接（NHEJ）、theta介导的末端连接（TMEJ）、单链退火（SSA）和同源定向修复（HDR），如图1所示。第一种途径NHEJ是一种容易出错的机制，它直接重新连接断裂的DNA末端，但末端处理较少，常常导致小的插入或缺失。NHEJ的启动是通过环状Ku70/Ku80蛋白异二聚体与DSB末端结合来实现的。这种结合具有双重作用：保护DNA末端免受进一步切割，并促进依赖DNA的蛋白激酶（DNA-PKcs）的招募。随后，DNA-PKcs协调LigIV-XRCC4-XLF复合体（由Ligase IV、X射线交叉互补组4和XRCC4类似因子组成）来连接DNA末端。在直接连接DSB末端不可行的情况下，需要额外的蛋白质（包括Artemis核酸酶、多核苷酸激酶3′磷酸酶（PNKP）和DNA聚合酶如Polμ和Polλ）来进行末端处理。

图1 哺乳动物中修复DNA双链断裂的四种主要途径：NHEJ、TMEJ、SSA和HDR

这些途径之间的一个主要区别在于它们所需的DNA末端切割程度。尽管Artemis-DNA-PKcs复合体可以轻微修剪DNA末端，但NHEJ主要通过Ku70-Ku80结合来保护末端。DNA-PKcs招募LigIV-XRCC4-XLF复合体来连接DNA末端。当直接连接不可行时，需要额外的因素（如Artemis和聚合酶μ和λ）进行末端处理。相比之下，CtIP和MRN复合体会进行广泛的切割，产生TMEJ、SSA和HDR所需的单链DNA突出端。在TMEJ中，PARP1招募Polθ来对齐微同源序列并合成DNA，然后用连接酶活性封闭切口。BLM和EXO1的进一步切割允许RPA结合单链DNA，支持SSA和HDR。RAD51通过在单链DNA上形成核蛋白纤维来促进链侵入，而RAD52则通过促进互补链的退火来辅助这一过程（基于Chang等人2017年的研究）。

第二种途径TMEJ（也称为替代非同源末端连接或Alt-NHEJ），是一种可以在修复过程中引入核苷酸变化的独特末端连接修复途径。TMEJ首先对DSB进行短距离切割。与NHEJ类似，该途径不需要模板即可修复受损DNA。相反，DSB末端的重新对齐是通过使用短的微同源序列（通常长度为2到6个碱基对）来实现的，这些序列位于受损DNA末端附近。短距离末端切割促进TMEJ，而更广泛的切割则倾向于支持SSA和HDR。在大多数后生动物中，末端切割的启动是由损伤感知的MRN复合体（MRE11-RAD50-NBS1）与其相互作用伙伴CtIP共同完成的。复制蛋白A（RPA）是一种单链DNA结合蛋白，通过抑制退火来发挥调节作用。相反，聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）作为TMEJ的促进者和动力学启动剂，帮助固定DNA片段并促进退火反应，尽管它不是该途径的必需条件。DNA聚合酶θ（Polθ，在人类中称为POLQ，在果蝇中称为mus308）能够将RPA从单链DNA上置换出来，从而促进TMEJ。在哺乳动物细胞中，Polθ稳定退火的突出端并可能通过模板导向的DNA合成填充由此产生的间隙。然而，有人假设Polθ的进程性和保真度较低，因此它仅从已退火的微同源序列开始合成，之后由更具进程性和准确性的Polδ取代。最后，剩余的切口由DNA连接酶I或III封闭。

SSA和TMEJ有几个共同点：它们都依赖3′单链DNA突出端来促进退火。与TMEJ不同，SSA依赖于EXO1或Bloom解旋酶（BLM）-DNA2的5′至3′外切酶活性进行广泛的末端切割，产生超过1000个核苷酸的长单链DNA突出端。然后RPA覆盖这些单链DNA突出端，接着Rad52结合并介导同源序列的退火。尚不清楚剩余的间隙是如何填充和连接的。SSA修复的结果通常是带有同源序列的广泛缺失。这些缺失是由于远端位点的同源配对引起的，随后在连接步骤之前修剪非同源的3′片段。值得注意的是，Helicase POLQ类似物（HELQ，在人类中称为HEL308，在果蝇中称为mus301/spindle-C）是一种与Polθ的N端区域同源的DNA解旋酶，存在于大多数真核生物中（植物除外）。最近的研究表明HELQ对SSA和其他形式的微同源介导的末端连接（MMEJ）是必需的。

剩下的途径HDR依赖于同源DNA模板进行精确修复，对于诸如目标敲入（KI）外源DNA或特定突变等精确的基因组修改是必需的，而其他途径通常会导致敲除（KO）突变。与SSA类似，HDR也需要长距离的末端切割，随后由RPA覆盖。随后，Rad51重组酶取代RPA，在单链DNA上形成长的螺旋纤维，抑制Rad52介导的SSA。最后，单链DNA与同源修复模板配对，使用单链DNA的3′侵入端来启动DNA合成，从而完成DSB修复。

虽然所有真核生物中的DSB修复途径的核心机制被认为高度保守，但在节肢动物（特别是昆虫）中的功能研究揭示了与哺乳动物模型的差异，包括途径组分的存在/缺失以及修复结果之间的平衡。对Aedes aegypti、Drosophila melanogaster和Homo sapiens的比较分析表明，核心DSB修复因子（如MRN复合体、Ku70/Ku80和RAD51）在A. aegypti和D. melanogaster中得以保留。然而，一些在哺乳动物中促进HDR的关键调节因子（如BRCA1、TP53BP1和PALB2）在这些物种中不存在。这可能表明，尽管DSB修复的基本途径在节肢动物中是保守的，但在NHEJ和HDR之间的选择调控与哺乳动物存在显著差异，这可能解释了在昆虫基因组编辑实验中有时观察到偏向末端连接的现象。

一种改变这种平衡的策略是使末端连接途径的组分失活或抑制它们。例如，在Bombyx mori细胞系中敲除NHEJ因子（包括Ku70、Ku80、LigIV、XRCC4和XLF）显著增加了HDR介导的修复。同样，在果蝇中，当提供供体DNA模板时，LigIV的缺失几乎完全使DSB修复转向HDR。然而，LigIV在果蝇中调节修复结果的作用似乎仍有争议，因为在LigIV敲除品系中对DSB修复的影响似乎变化很大。除了参与NHEJ的因子外，靶向参与TMEJ的蛋白也可以改善HDR，正如在人类细胞系中所观察到的那样。

尽管在各种模型系统（酵母、哺乳动物和昆虫）中已经取得了大量关于DNA修复途径的进展，但针对螯肢动物物种中这些途径及其层次结构的研究仍然不足。本研究专注于二斑叶螨（Tetranychus urticae）的DNA修复机制，这种农业害虫以其广泛的宿主范围和快速的抗药性发展而闻名。T. urticae的极端多食性已被广泛研究，该物种能够取食超过1000种植物。宿主转移研究表明，转换到不同或化学处理的宿主会引起转录重编程，特别是在解毒和主要代谢基因家族中，显示出高度的转录可塑性。

除了是一种重要的害虫外，T. urticae还是一个新兴的螯肢动物遗传模型，因为它具有注释完善的基因组、易于维持和杂交实验室种群、通过单倍二倍体繁殖生成近乎同基因的品系的能力，以及短世代时间和大的种群规模，有利于群体遗传学研究。遗传作图方法（如批量分离分析BSA）进一步提高了T. urticae作为模型系统的实用性。另一个促进其模型地位的重要因素是reverse genetics工具（如RNAi和CRISPR-Cas9）的可用性。这种工具的常规应用得益于最近开发的SYNCAS方法，该方法能够高效地将Cas9核糖核蛋白复合体传递到卵细胞中，通过母系注射Cas9 RNPs结合BAPC和皂苷，在注射雌性的后代中实现高敲除效率。该方法也被证明对其他难以转化的节肢动物（如Frankliniella occidentalis、Bemisia tabaci、Amblyseius swirskii和Phytoseiulus persimilis）中的基因敲除有效。此外，SYNCAS还促进了Orius strigicollis突变体的生成。虽然使用SYNCAS在T. urticae中成功引入了单核苷酸多态性（SNPs），但所得到的效率在不同研究中似乎有所不同。

在这里，我们鉴定了T. urticae中经典的DSB修复途径的直系同源物，并生成了一种或多种途径被破坏的突变螨虫品系，以研究它们对修复结果的影响。我们进一步研究了使用SYNCAS进行HDR介导的基因敲入的潜力和局限性，重点关注切割位点距离和插入片段大小的影响。我们的结果表明，T. urticae中的末端连接主要通过TMEJ介导，因为该途径的突变体几乎完全通过HDR修复DSB。此外，TMEJ突变体展示了提高基因编辑效率的潜力，突显了它们在该物种未来基因组工程应用中的价值。

结果
- 通过互惠BLASTp和tBLASTn分析，鉴定了T. urticae中与人类和果蝇DNA修复途径相关蛋白的假定直系同源物。与D. melanogaster和A. aegypti类似，许多关键人类途径的成分在该蜘蛛螨物种中无法被鉴定（表1）。特别是对于NHEJ途径，许多蛋白质似乎缺失或无法鉴定，包括DNA-PKcs、Artemis、聚合酶λ和μ、XLF、XRCC4、PAXX、APLF和APTX。对于其他途径，也缺少几个成分，其中最显著的是NBS1和CtIP，因为它们在人类中的末端切割中起着关键作用（图1）。
- 基于其他物种中的实验，ligIV和polθ被认为是创建NHEJ和TMEJ途径缺陷品系的有趣候选基因。为了加强鉴定并确定真正的同源性，我们接下来挖掘了一些节肢动物基因组中ligIV和polθ的存在，并进行了系统发育分析。人类基因NHEJTMEJHDRSSAD、黑腹果蝇（D. melanogaster）、荨麻虫（T. urticae）以及其他物种的基因也被纳入了分析范围。分析结果揭示了一些有趣的差异：

系统发育树显示，蜱虫、蜘蛛和蝎子的LigIV与其他螯肢动物（如蜱螨目Acariformes和寄生螨目Parasitiformes）相比，与脊椎动物的亲缘关系更为密切（尽管这种亲缘关系的支持度较低，如图S1和文件S1所示）。此外，LigIV在这些螨类中并不一致，仅能在少数Acariformes物种中被检测到，而在所有Parasitiformes物种中都存在。相比之下，Polθ在Acariformes中得到了保守。有趣的是，一个名为helq的基因与T. urticae的polθ基因位置接近，并且在T. urticae、T. truncatus和P. citri的polθ区域观察到保守的基因组合（如图S2和文件S1所示）。helq编码的蛋白质与Polθ非常相似（在Tetranychinae亚科中具有65%–80%的氨基酸一致性），但大小约为Polθ的一半（Tetranychinae中的1700–1800个氨基酸，而helq中只有950–1000个氨基酸），并且缺乏Polθ的C端DNA聚合酶结构域。

为了研究T. urticae中的DNA修复途径，我们使用CRISPR-Cas9技术生成了多种突变体株系，破坏了NHEJ、TMEJ或这两种途径。其中，LigIV-1和LigIV-2株系的ligIV基因被敲除，导致NHEJ功能丧失；而Polθ-P1、Polθ-P2、Polθ-P3和Polθ-HP株系的polθ基因发生突变，影响了TMEJ功能。同时，也观察到Polθ-HP株系中的polθ基因在两个结构域都发生了突变。

为了评估这些DNA修复途径对蜘蛛螨DNA修复的影响，我们使用CRISPR-Cas9针对植烯去饱和酶（pd）基因进行了编辑，并提供了一个含有终止密码子的单链寡脱氧核苷酸（ssODN）修复模板。切割pd后，DNA双链断裂（DSB）可以通过末端连接途径（NHEJ/TMEJ）或HDR途径得到修复，分别导致不同的突变结果。通过比较所有白化后代的序列，可以量化DSB诱导率和HDR效率。结果表明，在所有polθ被破坏的株系中，HDR的频率显著增加。

此外，我们还评估了KI（Knock-In）技术在Polθ KO株系中的表现。观察到，在Polθ-P1和Polθ-P2株系中，HDR效率明显高于野生型（WT）株系。进一步的研究表明，在30 nt距离切割位点的插入突变情况下，KI频率较低，这可能是由于这些白化个体未能成功整合终止密码子所致。此外，还分析了携带插入突变的突变体，发现TMEJ是这些突变的主要修复途径。

综上所述，TMEJ在Cas9诱导的卵母细胞DSB修复中发挥着关键作用，而NHEJ的作用可能非常有限或甚至不存在。在Polθ KO株系中，HDR频率显著提高，尤其是Polθ-P1和Polθ-P2株系。此外，分析表明，在白化雄性个体中检测到了微同源性序列，这些序列位于删除位点的两侧。与切割位点的距离类似，插入片段的增大对观察到的KI频率产生了负面影响，20 bp和38 bp的KI突变体被检测到，而100 bp的片段则没有被检测到（图6；表S3）。再次，Polθ-P1 linha在总体KI效率方面优于WT菌株。有趣的是，在使用100 bp插入片段的处理中，没有发现Polθ-P1中的白化突变体。

图6 插入片段大小对CRISPR-Cas9切割位点基因编辑结果的影响
显示完整标题
图查看器
（A）实验概念的图形表示。
（B）从上到下：注射后的雌性后代中表现出白化症状的百分比，成功整合了相应单链寡核苷酸（ssODN）修复模板中完整插入片段的百分比，以及含有终止密码子的后代百分比。x轴表示插入片段的大小和雌性在使用CRISPR-Cas9组件后的产卵时间间隔。黑色条形表示平均效率。图中的字母代表每个时间间隔内菌株之间的显著差异（α < 0.05）。用于生成图表的数据可以在表S3中找到。

图7 polθ KO的适应性成本评估
显示完整标题
图查看器
（A）用于生成初始混合种群的杂交实验的图形表示。
（B）基于Sanger色谱图中相对峰高的polθ KO等位基因频率随时间的演变（表S4，文件S5），其中使用了前三个不同的分叉峰进行计算。数据以这三个峰的平均值±标准误差（SEM）表示，并代表技术变异。这三个不同的KO菌株是生物学重复实验。

Polθ-P1菌株似乎有潜力促进KI突变体的产生，从而使未来在红蜘蛛螨中的基因编辑变得更加容易。然而，生物途径的破坏可能会产生不利影响，从而导致适应性成本。为了评估polθ KO菌株是否遭受适应性下降，我们将这三个突变体菌株与亲本菌株独立杂交，并允许等位基因在大量种群中分离和重组。在这个适应性实验中，相对等位基因频率被监测了总共30周（图7）。这些等位基因频率被转换为等位基因计数，假设每个样本有400个等位基因（200个二倍体雌性），并使用带有logit链接的二项式广义线性模型分析KO与WT的计数。模型包括“周数”作为连续预测因子，“种群”作为固定分类效应。很明显，“周数”对KO等位基因的对数几率有强烈的负面影响（估计值 = ?0.024 ± 0.002，z = ?10.47，p < 2 × 10?16），表明KO等位基因频率随时间显著下降。在首次采样时（第2周），不同种群之间的等位基因频率已经存在差异，Polθ-P2和Polθ-P3的起始值低于Polθ-P1，但所有种群随时间都显示出类似的下降趋势。-0.024的斜率相当于每周携带KO等位基因的几率大约下降2.4%，表明在三个生物学重复实验中，Polθ KO确实伴随着适应性成本。

在整个实验过程中，每个笼子中的红蜘蛛螨种群规模都保持较大，以避免瓶颈效应，每个笼子里有6-12株严重受感染的豆类植物。因此，实验过程中的种群规模应该在数千只螨虫的范围内，预计遗传漂变可以忽略不计。此外，KO等位基因频率在整个实验中保持在中等范围内（即没有一个极端情况，等位基因频率接近0或1），这意味着对数转换后的频率变化紧密遵循确定性选择模型。在这些条件下，等位基因频率下降的斜率应该接近选择系数s，对KO等位基因起作用。

讨论
基于CRISPR的T. urticae基因组编辑直到最近才通过SYNCAS方法变得可行。尽管现在可以高效地实现靶向突变，但通过HDR引入特定突变的效率一直不稳定。提高精确基因编辑的效果需要更深入地了解该物种中的DNA双链断裂（DSB）修复机制，因为DNA修复途径的使用决定了预期的编辑是通过HDR引入还是通过容易出错的末端连接引入随机突变。因此，本研究旨在表征T. urticae中的DSB修复途径的架构，并确定特定途径的缺失如何影响基因编辑结果。基因组分析显示，在T. urticae中无法识别出经典NHEJ途径几个核心组件的假定同源物，包括DNA-PKcs、XRCC4和XLF，而TMEJ、SSA和HDR共有的其他因素（如NBS1和CtIP）也似乎不存在。LigIV和Polθ的系统发育分析进一步表明，LigIV在螨虫中的保守性较低，这与T. urticae中其他NHEJ因素的基因组缺失相呼应，而Polθ在蜱螨类中得到了广泛保留。虽然这表明螨虫中的末端连接机制有所减弱，但现在就断言NHEJ完全冗余还为时过早。在其他无脊椎动物中，使用哪种DNA修复途径很大程度上取决于特定组织和DNA断裂的类型。例如，在秀丽隐杆线虫中，体细胞使用经典NHEJ进行某些修复，而生殖细胞几乎完全依赖TMEJ。特别是在使用CRISPR/Cas9时，NHEJ没有发挥可检测的作用。因此，我们的实验只能提供关于卵细胞/早期胚胎中发生的DNA修复的见解。这些实验表明，polθ的破坏导致了向HDR的接近完全转变，表明T. urticae卵中的DSB修复主要依赖于TMEJ，且TMEJ和HDR直接竞争。相比之下，ligIV KO螨虫的修复结果几乎没有变化，这与秀丽隐杆线虫生殖细胞中的观察结果一致。在其他生物体中，如斑马鱼Danio rerio和埃及伊蚊Aedes aegypti中，TMEJ似乎在胚胎阶段占主导地位。有趣的是，即使在同时破坏了NHEJ和TMEJ的两个双KO菌株中的一个中，单个修复事件仍然显示出与预期HDR事件不同的有害突变。这可能表明T. urticae中存在其他修复途径，如SSA。与此假设一致的是，T. urticae携带人类HELQ的同源物HELQ，已知HELQ对SSA是必需的。然而，SSA途径通常会产生由同源序列包围的大片段缺失，而这在这里并未观察到。另一种可能性是，不完整的HDR事件，其中修复模板仅部分使用，可能会产生类似于诱变末端连接的异常连接，正如在斑马鱼Danio rerio中观察到的那样。此外，在794只白化螨虫中有21只无法获得PCR产物来确定突变的类型。不能排除这些PCR失败是由于存在大片段缺失（可能是由于SSA修复）导致一个或两个引物结合位点丢失。进一步分析白化螨虫中的突变发现，WT和ligIV KO菌株中都存在1到4个核苷酸的微同源性，其中1和2个核苷酸的微同源性最为常见。这与秀丽隐杆线虫中的观察结果一致，研究表明单个核苷酸的微同源性已经足以实现TMEJ。在某些情况下，直接位于缺失端的微同源性并未发现。这可能是因为Polθ容忍了微同源性中的不匹配，正如最近的研究所暗示的那样，掩盖了使用了微同源性。除了使用微同源性外，TMEJ的另一个典型特征是模板插入的发生，这是由于Polθ驱动的微同源性配对和合成循环的中断。当初次尝试对齐和稳定断裂的单链末端失败时，Polθ会解离，切换模板，并使用相邻序列启动新的引物化和延长过程，然后进行最终连接。这些插入的原始基因组模板通常位于断裂位点附近。

在Polθ编码序列完全破坏的突变体菌株（Polθ-HP）与编码解旋酶结构域的序列仍然完整的菌株（Polθ-P1和Polθ-P2）之间，未观察到HDR:EJ比率的显著差异。鉴于聚合酶结构域在TMEJ中的作用，这一结果并不出乎意料。在DNA末端被切除并形成短微同源性之后，中间产物是不稳定的，含有间隙、不匹配和突出端。聚合酶结构域从退火的微同源性开始填充间隙，稳定连接，并将损伤记录为TMEJ途径。解旋酶结构域移除如RPA这样的单链DNA结合蛋白，并促进短微同源性的退火，稳定初始的末端连接中间体，但不已知参与链的合成。如果没有聚合酶结构域来启动填充合成，这些活动本身不足以生成可以连接的产物，因此TMEJ会失败。然而，我们没有验证Polθ-P1和Polθ-P2中的解旋酶结构域是否正确折叠并因此具有功能，因为多结构域蛋白的截断可能会影响其折叠、寡聚化或稳定性。因此，根据本工作中提供的数据，无法对Polθ-P1和Polθ-P2中的解旋酶功能得出强有力的结论。

就整个后代中发生的HDR而言，polθ KO菌株显示出的HDR频率显著高于WT菌株（图4，文件S3）。此外，Polθ-P1和Polθ-P2中的HDR频率也远高于Polθ-HP，这可能暗示解旋酶结构域在HDR中起作用。如果是这种情况，那么LP-1和LP-2中的HDR频率也应该更高，因为这些菌株含有相同的KO等位基因。不同polθ KO菌株之间的巨大差异也可能是由于这些菌株之间的遗传变异，因为这些菌株是通过回交来修复KO等位基因而建立的。因此，从WT GSS种群中分离出的可能影响基因编辑结果的等位基因（例如，影响Cas9在卵中的摄取的因素）可能在某些KO菌株中得到了修复，而在其他菌株中丢失了。然而，一个更合理的解释是这只是实验变异，因为每个菌株只进行了三次重复注射。

探测Cas9切割位点与引入特定突变的兴趣位置之间的允许距离的实验表明，距离的增加对KI效率产生了负面影响。这一结果符合预期，因为在其他生物体中也观察到类似的现象，其中高效的ssODN介导的编辑仅限于靠近DSB的区域。例如，在秀丽隐杆线虫中，Paix及其同事表明，当ssODN介导的编辑位于距离Cas9切割位点约10个核苷酸范围内时效率最高，随着距离的增加效率急剧下降。然而，效率的降低在很大程度上取决于使用的ssODN的方向，因为在PAM远端区域的编辑使用目标链（与gRNA互补）更有效，而在PAM近端区域的编辑使用非目标链（与gRNA序列相同）效果最好。在这里，编辑仅在PAM远端区域使用目标链进行。

来自哺乳动物系统的额外机制见解支持这一趋势。Harmsen等人证明，DNA错配修复（MMR）活性可以抑制ssODN介导的替换，特别是当预期编辑距离DSB较远时。这表明，高效的碱基对替换依赖于与切割位点的接近程度以及逃避错配识别途径的能力。Dekker等人（2011年）的补充证据表明，在小鼠胚胎干细胞中，暂时抑制MMR蛋白MLH1显著提高了使用ssODN的单碱基替换效率。这些发现表明，ssODN介导的编辑效率受到与DSB的物理距离和细胞DNA修复途径的双重调节，突显了仔细设计ssODN的重要性，在某些情况下，还需要暂时调节修复蛋白以最大化编辑效果。研究MMR对T. urticae基因编辑的影响可能会进一步提高CRISPR-Cas工具在该物种中的实用性。我们的结果还表明，在T. urticae中，插入片段的大小与HDR（同源重组）效率之间存在明显的负相关。虽然在polθ KO品系中，20 bp和38 bp的短插入片段的引入效率仍然相对较高，但尝试引入100 bp的插入片段时未能生成任何可检测到的KI（基因敲除）个体。鉴于该方法在所有其他实验中的稳健性，这不太可能是CRISPR方法在三次重复实验中的单纯失败。更有可能的情况是，Cas9成功切割目标位点的后代无法修复DSB（双链断裂），并在发育过程中死亡。这一结果表明，该物种在基因敲除方面存在意外的限制，因为100 bp的插入片段与其他使用单链DNA（ssDNA）作为修复模板的生物相比并不特别大。例如，在斑马鱼中，ssDNA供体已经实现了750 bp片段的成功插入，在小鼠胚胎中也获得了超过1 kb片段的ssDNA介导的KI。即使在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，也 report 了180 bp片段的成功插入，这表明当使用ssDNA模板时，T. urticae的HDR能力受到异常限制。然而，由于我们的实验筛选深度可能有限，因此无法得出确定的结论，因为只有360只雄性个体被用于分析100 bp插入片段的情况。如果注射更多雌性个体并筛选数千个后代，仍然有可能找到成功的KI突变体。此外，使用双链DNA（dsDNA）模板代替单链DNA或不同的同源臂长度可能会提高较大构建物的KI成功率。此外，需要注意的是，与许多模型生物不同，后者通过注射胚胎来传递大型DNA构建物，SYNCAS方法基于母体注射。因此，将大型DNA模板传递给卵子可能是另一个限制因素，从而限制了较大构建物的KI。HDR效率还受到细胞周期的影响，因为在S期和G2期，当姐妹染色单体或同源模板可用时，修复机制最为活跃。在G1期或早期S期产生的DSB通过HDR修复的效率较低，更可能通过末端连接途径解决。在T. urticae中，Cas9诱导DSB时卵子的确切细胞周期阶段尚不清楚。较大的插入片段需要更广泛的DNA合成，如果HDR在S/G2期后期启动，可能没有足够的时间或细胞资源在细胞进入有丝分裂前完成修复，导致整合失败。无论原因是什么，使用ssDNA作为修复模板来插入大型DNA片段可能是一个具有挑战性的策略。因此，未来尝试在蜘蛛螨中诱导转基因的研究也可以考虑其他方法，如使用线性dsDNA供体，这些供体可以作为HDR和末端连接途径的模板，从而允许在HDR受限或不完整的细胞中整合供体DNA。通过利用HDR和末端连接机制，dsDNA供体可能会增加在T. urticae中恢复转基因插入的可能性，克服使用ssDNA模板时观察到的大小限制。仔细设计供体，包括适当的同源臂和防止降解或聚集的措施，对于最大化整合效率可能是至关重要的。然而，如前所述，通过母体注射将大型构建物传递给卵子可能是需要克服的第一个障碍。在最后的实验中，观察到在实验室条件下（即低紫外线条件下），polθ的缺失导致了可测量且显著的适应性成本。这是通过随时间监测等位基因频率来确定的，这是一种强大的适应性评估方法，因为它整合了整个生命周期和现实竞争条件下的所有适应性组成部分（生存能力、发育、繁殖、性别特异性效应等）。我们的实验从受控杂交开始，生成杂合子F1群体，然后将其与KO品系回交以建立F2起始群体。这种设计允许F1雌性发生重组，从而在KO位点周围实现遗传背景的均质化。另一种方法是从KO品系和WT品系的雌性中各取等量混合来起始群体。然而，这样起始的等位基因频率可能会受到遗传漂变的影响，因为只有少数雄性产生后代，而且可能在整个螨虫品系上而不是在KO等位基因本身上发生选择。从受控杂交和强制性杂合子开始可以确保初始等位基因频率的平衡，减少创始人效应，并确保两个等位基因在相似的遗传基础上进入实验。因此，后续世代中KO等位基因频率的下降可以更可靠地归因于与KO等位基因本身相关的适应性成本，而不是与KO品系的遗传背景（从WT品系选择的单倍型）相关的无关适应性差异。在这些通过直接杂交建立的群体中，KO等位基因频率在30周的采样期间缓慢下降，表明尽管polθ的破坏不是致命的，但它降低了竞争力。其他生物中也报告了由于Polθ缺失而产生的有害效应。在小鼠中，观察到染色体不稳定性和对DNA损伤剂敏感性的增加，而在斑马鱼胚胎中，在诱导DSB后胚胎无法存活。对黑腹果蝇（D. melanogaster）的研究表明，Polθ的缺失不会立即导致致命性，但会损害基因组稳定性和适应性。例如，null突变体是可存活的，但它们对电离辐射和化学诱变剂更为敏感，这与Polθ在修复受损染色体中的作用一致。此外，这些突变体在DNA断裂被诱导时表现出更高的有丝分裂交叉率，表明Polθ通常抑制可能导致染色体不稳定的重组事件。进一步的工作可以评估在DNA损伤条件下polθ KO在T. urticae中的适应性成本，并研究其与WT品系相比的突变率的影响。考虑到这种适应性成本，对于未来使用polθ KO品系的工作来说是一个重要的考虑因素，因为它可能会混淆表型分析的结果。

结论
本研究中使用SYNCAS方法进行的CRISPR-Cas9实验表明，在T. urticae中引入的DSB主要通过TMEJ（末端连接）途径修复。此外，尽管引入的DNA片段大小似乎有限，但polθ KO品系仍可以通过ssODN（单链DNA）产生KI突变体，因此为该物种未来的遗传研究提供了一个有价值的工具。

研究的局限性
本研究的一个重要局限性是所使用的SYNCAS方法的组织特异性，它依赖于母体注射来靶向卵子和早期胚胎。因此，观察到的TMEJ修复占主导地位仅代表生殖细胞和早期胚胎环境，这意味着体细胞组织中NHEJ（核苷酸交换修复）的冗余或必要性尚未确定。此外，我们关于较大片段（例如100 bp）无法实现KI状态的结论受到我们筛选深度（360只雄性后代）的限制，这留下了较大片段可能以非常低的频率整合的可能性，只有通过大规模筛选才能检测到。此外，虽然在完全KO（Polθ-HP）品系和聚合酶缺陷品系（Polθ-P1,2）之间没有观察到表型差异，但由于这些截短片段的稳定性、折叠或寡聚化尚未明确验证，因此N末端解旋酶域的独立功能作用仍然不清楚。最后，不同的KO品系可能还由于亲本GSS品系中的遗传变异而在其他等位基因上也存在差异。这些遗传差异可能会影响实验结果，并部分导致不同KO品系之间的表型变异。

资源可用性
如有进一步信息和资源的需求，请联系主要联系人Thomas Van Leeuwen（[e-mail]）。

材料可用性
本研究生成的螨虫品系可以根据请求提供，但可能需要支付费用和/或签署材料转移协议。

数据和代码可用性
• 支持本工作的所有数据可以在本文的补充信息和Figshare（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32475891）上找到。
• 本文不报告原始代码。
• 任何需要重新分析本文报告的数据的信息均可向主要联系人请求获得。

致谢
本研究得到了Horizon 2020研究与创新计划（ grant 101136611-NEXTGENBIOPEST）和弗兰德斯研究基金会（FWO）（grants G017923N和G0A1525N）的支持。S.D.R.是FWO的博士后研究员（grant 1237426N）。

作者贡献
概念构思：S.D.R.和T.V.L.；实验操作：S.D.R.；数据管理：S.D.R.和W.D.；资金获取：S.D.R.和T.V.L.；方法论：S.D.R.、W.D.和T.V.L.；可视化：S.D.R.和W.D.；写作-初稿：S.D.R.；写作-审阅和编辑：S.D.R.、W.D.和T.V.L.。

利益声明
作者声明没有竞争利益。

写作过程中使用的人工智能和AI辅助技术
在准备这项工作时，作者使用了Gemini工具来改进写作风格。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

STAR★ 方法
关键资源表

试剂或资源
源标识符
化学品、肽和重组蛋白
Alt-R? S.p. Cas9核酸酶 V3
Integrated DNA Technologies
10007808BAPtofect? (BAPC)
Phoreus Biotech/Quillaja皂苷
Sigma-Aldrich
S4521GoTaq? G2 DNA聚合酶
Promega
M7845GoTaq? qPCR预混液
Promega
A6001蛋白酶K
Sigma-Aldrich
P6556Allura red AC
Sigma-Aldrich
458848琼脂糖
ThermoFisher
16500500
关键商业试剂
RNeasy plus试剂盒
Qiagen
73404
Maxima第一链cDNA合成试剂盒
Thermo Fisher Scientific
K1641D
Neasy血液和组织试剂盒
Qiagen
69504

存档数据
原始数据
本文：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32475891
Bryobia sp.从头组装序列
NCBI序列读取存档
访问号：SRR15410508
Tetranychus urticae基因组数据库
ORCAE：https://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/Tetur
Drosophila melanogaster基因组资源
FlyBase：https://flybase.org

实验模型：生物/品系
Tetranychus urticae：GSS品系
Prof. Thomas van leeuwen实验室
Stumpf等人

寡核苷酸
单一引导RNA（文件S4）
Integrated DNA technologies/ssODN修复模板（文件S4）
Integrated DNA technologies/基因分型和RT-qPCR引物（文件S4）
Integrated DNA technologies/软件和算法
CRISPOR
Concordet和Haeussler：https://crispor.gi.ucsc.edu/CLC基因组工作台（版本24）
QIAGEN MAFFT
Katoh等人：2002：https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/IQ-TREE
nguyen等人：https://iqtree.github.io/ModelFinder
Kalyaanamoorthy等人：https://iqtree.github.io/InterProScan
Jones等人：https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/Primer-BLAST
NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/qbase+
Biogazelle BioEdit软件（版本7.2.5）
Hall：https://bioedit.software.informer.com/
Python（版本3.12）
Python软件基金会：https://www.python.org/
其他
Nanoject III微量注射器
Drummond Scientific/3–000-203-G/X玻璃毛细管
Drummond Scientific/P1000微量吸管拉拔器
Sutter instruments/BV-10微量吸管斜面器
Sutter instruments/M205FCA显微镜
Leica/VHX-970F数字显微镜
Keyence/VH-Z50镜头
Keyence/DeNovix? DS-11 FX分光光度计
DeNovix/Mx3005P qPCR仪器
Agilent technologies：在新标签页中打开的表格

实验模型和研究参与者详情
所有实验均使用Stumpf等人描述的T. urticae的GSS品系进行。螨虫在Phaseolus vulgaris cv. Prelude上培养，在26°C、60%相对湿度（RH）和16:8光照周期下进行。为了确保实验中的螨虫年龄相近，将成年雌虫放在湿润的棉花上的豆叶上产卵24小时，然后移除。8天后，将雌性若虫转移到新的豆叶上，不放雄虫以确保不会发生受精，从而产生的后代为单倍体雄虫。这些雌虫在实验进行前（处于成年阶段3-4天）一直留在叶子上。实验后，螨虫在相同的条件下保存在培养箱中。

T. urticae中DSB修复蛋白假定同源物的筛选
使用ORCAE（https://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/Tetur）中的互惠BLASTp搜索（如果没有找到匹配项则使用tBLASTn）鉴定了与人类和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）DNA修复途径相关的T. urticae假定同源物。从Swiss-Prot检索的人类已知DNA修复因子序列和从FlyBase检索的D. melanogaster序列使用BLASTp与T. urticae蛋白数据库（Tetur_PEP_LAST）进行查询，并使用tBLASTn和参考基因组（T.urticae_LONDON_GENOME）进行查询。随后，使用候选的T. urticae蛋白作为查询，在NCBI上与人类或D. melanogaster参考蛋白质组进行互惠BLASTp搜索（refseq_select）。当反向BLASTp将原始查询蛋白作为最高命中结果返回时，这些蛋白被认为是假定的直系同源物。确定了T. urticae的ligIV和polθ，并研究了ligIV和polθ在蜱螨类物种中的分布。首先使用D. melanogaster中的LigIV（FBgn0030506）和Polθ（FBgn0002905，也称为Mus308）蛋白序列作为查询，在NCBI中的T. urticae预测蛋白质组上进行BLASTp搜索（T. urticae注释版本101）。每个查询中排名最高的T. urticae命中结果被用于反向BLASTp搜索，以确认假定的T. urticae LigIV和Polθ直系同源物的身份。随后，使用T. urticae的LigIV和Polθ对以下蜱螨类群/超科/目的预测蛋白质组进行了反向BLASTp搜索：Ixodida（蜱虫，Rhipicephalus microplus、R. sanguineus和Ixodes scapularis）、Mesostigmata（Varroa destructor和Galendromus occidentalis）、Astigmata（Dermatophagoides pteronyssinus）、Oribatida（Archegozetus longisetosus和Oppia nitens）、Eriophyoidea（Aculops lycopersici和Fragariocoptes setiger）、Parasitengona（Leptotrombidum deliense和Dinothrombium tinctorum）、Eupodinae（Halotydeus destructor）、Eleutherengona（Heterostigmata（Pyemotes zhonghuajia和Polyphagotarsonemus latus）以及Tetranychoidea（Brevipalpus yothersi、Panonychus citri、Amphitetranychus viennensis、Tetranychus truncatus和T. urticae伦敦株及IPM株）。为了不遗漏未注释的ligIV，使用T. urticae LigIV对这些物种的基因组进行了tBLASTn搜索。除了上述蜱螨类物种外，我们还使用tBLASTn搜索和T. urticae LigIV及Polθ作为查询，挖掘了另一种Tetranychoidea成员Bryobia sp的基因组。Bryobia sp的基因组使用CLC Genomics Workbench版本24和默认设置进行了从头组装，序列读取档案的访问号为SRR15410508。蜱螨类中的LigIV和Polθ蛋白通过Chelicerata（Centruroides sculpturatus和Parasteatoda tepidariorum）、昆虫（Bombyx mori、Tribolium castaneum）、甲壳类（Daphnia pulex）、脊椎动物（Homo sapiens、Danio rerio和Xenopus laevis）以及真菌（Neurospora crassa）的蛋白进行了补充。对于所有物种（Bryobia sp除外），用于BLASTp/tBLASTn的访问号和/或注释/基因组在文件S1中显示。LigIV和Polθ蛋白分别使用MAFFT和FFT-NS-I及E-INS-I选项进行了比对，得到的LigIV和Polθ比对结果用于使用IQ-TREE和默认设置的最大似然性系统发育分析，采用的模型为LG + F + I + G4（由ModelFinder确定为最佳拟合模型），并进行了1000次超快自举。最终的系统发育树以Neurospora crassa的LigIV和Polθ为根。最后，使用InterProScan确定了T. urticae LigIV和Polθ中的InterPro结构域，而R包Gviz用于可视化Tetranychinae物种中polθ和helq的基因组区域。

通过SYNCAS方法使用CRISPR-Cas9创建了ligIV和polθ的KO系。简而言之，对于每个目标位点，将200只成年 virgin 雌性蜱虫固定在用Allura red染色的2%琼脂糖凝胶上，其背部与琼脂接触。然后通过腹部注射3 nL的CRISPR-Cas9溶液到第三对腿之间的体腔内，该溶液含有15 μg/μL的Cas9、6 μg/μL的sgRNA（针对1个目标）、1 μg/μL的BAPC和0.1 μg/μL的Quillaja皂苷。使用CRISPOR设计了间隔序列（文件S4）以最小化潜在的脱靶切割。重组的Streptococcus pyogenes Cas9蛋白（Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3）和sgRNAs从Integrated DNA Technologies购买。BAPC（BAPtofect）和Quillaja皂苷（Cat# S4521）分别从Phoreus Biotech和Sigma-Aldrich订购。所有注射均使用Nanoject III微注射器（Drummond Scientific）完成，针头由300-203-G/X玻璃毛细管制成（Drummond Scientific）。使用P-1000微吸管拔取器（Sutter Instruments）以以下参数进行操作：“加热：500、拔取：60、速度：70、延迟：200、压力：500、斜坡：490”，并用BV-10微吸管修锥器（Sutter Instruments）以15°角度修尖针头。注射在M205FCA显微镜（Leica）下进行。注射后，让雌蜱产卵总共48小时。从注射后24–48小时产生的卵中孵化出成年雄蜱，并将其与未受精的雌蜱交配。两天后，通过将个体压碎在10 μL STE缓冲液（100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8）和1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）中提取DNA。这种粗提物在37°C下孵育30分钟，然后在98°C下灭活蛋白酶K 10分钟。使用GoTaq G2 DNA聚合酶和针对目标位点的引物对对这些原始DNA提取物进行PCR扩增，这些引物对是通过Primer-BLAST设计的（文件S4）。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上进行检测，并送往LGC Genomics进行Sanger测序。一旦鉴定出携带KO突变的雄蜱，其杂合子 daughters 被用于后续的近亲繁殖以建立稳定的KO系。因此，获得了两个ligIV系（LigIV-1和LigIV-2）和四个polθ系（Polθ-P1、Polθ-P2、Polθ-P3和Polθ-HP）。测序结果在文件S2中提供。通过将LigIV系与Polθ系（LigIV-1 x Polθ-P1和LigIV-2 x Polθ-P2）杂交，创建了两个双KO系（LP-1和LP-2）（图S5所示）。

为了确定这些实验中注射后排卵的时间间隔，300只 virgin 雌蜱被注射了针对pd基因的CRISPR-Cas9混合物，该基因的KO会导致白化（图3B）。然后让雌蜱在注射后的以下时间间隔内排卵：0–18小时、18–21小时、21–25小时、25–41小时、41–44小时和44–48小时。这个过程重复了三次，根据这些结果（表S5），决定让雌蜱在注射后0至18小时和18–44小时内排卵，用于所有KI实验。在第一个实验中，各种ligIV和polθ KO系被注射了包含一个ssODN模板的CRISPR-Cas9混合物，该模板旨在在Cas9切割位点引入一个终止密码子（图3，文件S4）。得到的CRISPR-Cas9混合物由18.8 μg/μL的Cas9、7.5 μg/μL的sgRNA、5.2 μg/μL的ssODN、5.2 μg/μL的BAPC和0.1 μg/μL的Quillaja皂苷组成。每个KO系分别进行了三次独立实验，每次注射100只 virgin 雌蜱。结出的雄性后代被评估是否出现白化，随后对白化个体进行Sanger测序，以分析pd基因在Cas9切割位点发生的突变类型（随机插入和删除 vs. 引入终止密码子）。因此，可以比较不同系之间的KO和KI频率，计算方法如下：
$$
\%KO = \frac{#KO individuals}{#all individuals} \times 100\%
$$

对于显示KO突变的样本，分析了插入缺失（indels），并确定了微同源区域，总结在文件S6中。在另一个实验中，使用不同的ssODN修复模板评估了Polθ-P1中的KI频率，并与WT GSS株进行了比较，这些模板的插入大小和与Cas9切割点的距离不同，但仍导致pd基因的破坏（文件S4）。同样，每个系注射了100只 virgin 雌蜱的三次重复实验，然后分析了白化后代。

使用RNeasy Plus试剂盒（Qiagen）从WT GSS株以及Polθ-P1和Polθ-P2株中提取RNA，每种株各使用100只成年雌蜱。使用DeNovix DS-11 FX分光光度计（DeNovix，美国）测定RNA样品的浓度，并通过1%琼脂糖凝胶进行质量评估。使用Maxima First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）将1 μg RNA转化为cDNA，然后在Mx3005P qPCR机器（Agilent Technologies，比利时）中使用GoTaq qPCR Master Mix（Promega，美国）和qPCR引物（文件S4）进行RT-qPCR反应。循环条件为95°C 2分钟，随后是40个循环：95°C 15秒、55°C 30秒和60°C 30秒，最后进行熔解曲线分析。熔解曲线和无模板对照（NTC）分别用于确认扩增的特异性和污染的缺失。使用qbase+程序（Biogazelle，比利时）分析原始定量循环（Cq）值，所有值首先相对于内参基因ubiquitin C（tetur03g06910）和GAPDH（tetur25g00250）进行了标准化。每个样本使用两个技术重复样品，计算相对于参考基因的平均log2FC值。

为了评估polθ的破坏是否与适应性成本相关，通过将50只 virgin WT 雌蜱与50只Polθ-P1、Polθ-P2或Polθ-P3雄蜱杂交，生成了三个群体。得到的杂合F1雌蜱与它们相应的突变亲本系雄蜱回交（图7）。在配对后三天，每系让100只F1雌蜱在24小时内产卵，然后将这些同步的F2卵接种到单株豆株上。随着时间的推移，通过增加更多的豆株（总共最多12株）来扩增群体，并保持至少6株高度感染的豆株以避免群体瓶颈。通过监测群体中的KO等位基因频率来评估适应性。在接种豆株两周后开始定期采样螨虫，总共有二十周的采样时间，之后再采样一次。从每株随机挑选的四片叶子中各采集50只雌蜱，每个样本共采集200只螨虫。根据制造商的说明使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德国）从每个样本中提取DNA。使用引物对“polymerase θ (polymerase domain)”（文件S4）进行PCR扩增，然后将产物送至LGC Genomics进行Sanger测序。使用BioEdit软件（版本7.2.5）分析Sanger色谱图并测量WT和KO等位基因的峰高。相对等位基因频率通过取WT和KO等位基因差异的前三个核苷酸位置的平均值来计算（文件S5）：

$$
\frac{KO alleles}{total alleles} \times 100\%
$$

为了比较不同的DNA修复KO系，创建了两个双KO系（LP-1和LP-2），通过将LigIV系与Polθ系（LigIV-1 x Polθ-P1和LigIV-2 x Polθ-P2）杂交获得。

为了确定这些实验中注射后排卵的时间间隔，300只 virgin 雌蜱被注射了针对pd基因的CRISPR-Cas9混合物，该基因的KO会导致白化（图3B）。然后让雌蜱在注射后的以下时间间隔内排卵：0–18小时、18–21小时、21–25小时、25–41小时、41–44小时和44–48小时。这个过程重复了三次，根据这些结果（表S5），决定让雌蜱在注射后0至18小时和18–44小时内排卵，用于所有KI实验。在第一个实验中，各种ligIV和polθ KO系被注射了包含ssODN模板的CRISPR-Cas9混合物，该模板旨在在Cas9切割位点引入一个终止密码子（图3，文件S4）。得到的CRISPR-Cas9混合物由18.8 μg/μL的Cas9、7.5 μg/μL的sgRNA、5.2 μg/μL的ssODN、5.2 μg/μL的BAPC和0.1 μg/μL的Quillaja皂苷组成。每个KO系分别进行了三次独立实验，每次注射100只 virgin 雌蜱。对得到的雄性后代进行白化评分，然后对白化个体进行Sanger测序，以分析pd基因在Cas9切割位点发生的突变类型（随机插入和删除 vs. 引入终止密码子）。因此，可以比较不同系之间的KO和KI频率，计算方法如下：
$$
\text{KO and KI frequencies} = \frac{#KO individuals}{#all individuals} \times 100\%
$$

对于显示KO突变的样本，分析了插入缺失（indels）并确定了微同源区域，总结在文件S6中。在下一个实验中，评估了Polθ-P1中的KI频率，并与WT GSS株进行了比较，使用不同的ssODN修复模板，这些模板的插入大小和与Cas9切割点的距离不同，但仍导致pd基因的破坏（文件S4）。同样，每个系注射了100只 virgin 雌蜱的三次重复实验，然后分析了白化后代。

使用RNeasy Plus试剂盒（Qiagen）从WT GSS株以及Polθ-P1和Polθ-P2株中提取RNA，每种株各使用100只成年雌蜱。使用DeNovix DS-11 FX分光光度计（DeNovix，美国）测定RNA样品的浓度，并通过在1%琼脂糖凝胶上进行检测来评估质量。使用Maxima First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）将1 μg RNA转化为cDNA，然后使用GoTaq qPCR Master Mix（Promega，美国）和qPCR引物（文件S4）在Mx3005P qPCR机器（Agilent Technologies，比利时）进行RT-qPCR反应。循环条件为95°C 2分钟，随后是40个循环：95°C 15秒、55°C 30秒和60°C 30秒，最后进行熔解曲线分析。熔解曲线和无模板对照（NTC）分别用于确认扩增的特异性和污染的缺失。使用qbase+程序（Biogazelle，比利时）分析原始定量循环（Cq）值，所有值首先相对于内参基因ubiquitin C（tetur03g06910）和GAPDH（tetur25g00250）进行了标准化。每个样本使用两个技术重复样品，并计算相对于参考基因的平均log2FC值。

为了评估polθ的破坏是否与适应性成本相关，通过将50只 virgin WT 雌蜱与50只Polθ-P1、Polθ-P2或Polθ-P3雄蜱杂交生成了三个群体。得到的杂合F1雌蜱与它们各自的突变亲本系雄蜱回交（图7）。在建立配对后三天，让每个系的100只F1雌蜱在24小时内产卵，然后将这些同步的F2卵接种到单株豆株上。随着时间的推移，通过添加更多的豆株来扩增群体（总共最多12株），并保持至少6株高度感染的豆株以避免群体瓶颈。通过监测群体中KO等位基因的频率来评估适应性。在接种豆株两周后开始采样螨虫，每隔两周采样一次，总共采样二十周，之后再采样一次。从每株随机挑选的四片叶子中各采集四片叶子，每片叶子采集50只雌蜱，每个样本总共采集200只螨虫。根据制造商的说明使用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen，德国）从每个样本中提取DNA。使用引物对“polymerase θ (polymerase domain)”（文件S4）进行PCR扩增，然后将产物送至Sanger测序。使用BioEdit软件（版本7.2.5）分析Sanger色谱图并测量WT和KO等位基因的峰值高度。相对等位基因频率通过取WT和KO等位基因差异的前三个核苷酸位置的平均值来计算（文件S5）：

$$
\frac{KO alleles}{total alleles} \times 100\%
$$

为了比较不同的DNA修复KO系，创建了两个ligIV KO系和四个来自不同突变G0雄蜱的polθ KO系，以获得生物 replicates。对于每个获得的突变系，进行了三次独立注射。同样，对于其他基因编辑实验，每个处理组在每个螨虫系中也进行了三次独立注射。对于polθ的适应性实验，使用Polθ-P1、Polθ-P2和Polθ-P3设置了三个独立的笼子实验作为生物 replicates。基因编辑结果的统计分析在R（版本4.5.2）中进行。对于每个数据集和时间点间隔（0–18小时和18–44小时），通过汇总每个株内的重复次数构建了列联表。