生物源性羟基磷灰石的表面钙富集通过Toll样受体4信号调控巨噬细胞炎症

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Surface Calcium Enrichment of Biogenic Hydroxyapatite Regulates Macrophage Inflammation via Toll-Like Receptor 4 Signaling

　　

生物源性羟基磷灰石（biogenic hydroxyapatite, BHA）广泛用于口腔骨缺损再生，但其成骨功效受限于缓慢的成骨过程和不足的骨量，这可能归因于早期炎症反应。颗粒状生物材料的研究进一步受到传统体外（in vitro）模型的挑战，这些模型无法确保充分的细胞–材料相互作用和高效的RNA提取，限制了实验可靠性。在此，研究人员开发了一种改进的直接共培养系统及优化的RNA提取策略以解决上述局限。利用该平台，研究人员在基因、蛋白和转录组水平表征了BHA诱导的炎症反应。结果表明，BHA的炎症活性与其钙富集表面相关，该表面激活Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）信号通路。此外，研究人员引入钙预吸附策略以调节表面离子活性，该策略减少了钙富集并减弱了炎症信号。这些发现表明，调节钙富集能力可能为调控羟基磷灰石基骨替代物的免疫应答并改善其生物学性能提供一种有前景的策略。

口腔骨缺损常由牙周炎、创伤或肿瘤切除导致，临床对骨移植材料需求日益增加。生物源性羟基磷灰石（biogenic hydroxyapatite, BHA）因其良好的骨传导性，广泛用于引导骨再生（guided bone regeneration, GBR）和牙槽嵴保存（alveolar ridge preservation, ARP），但存在成骨缓慢和骨量不足等局限，这可能与材料植入早期诱导的炎症反应有关。材料植入后的早期炎症反应对后续组织再生起关键调控作用，适度炎症有利于愈合，而过度或持续炎症会损害骨形成。因此，阐明BHA诱导的炎症效应及其机制、开发免疫调控策略十分必要。然而体内炎症受材料效应、软组织厚度、手术操作等多种混杂因素干扰，难以分离材料本身的固有免疫效应。现有间接培养模型无法实现细胞–材料接触，而直接培养模型用于毫米级颗粒材料时存在颗粒分布不均、接触不充分和RNA提取效率低等问题。为此，研究人员建立了改进的直接共培养系统和优化的RNA提取策略，系统研究BHA激活的炎症信号通路，并通过钙预吸附策略探索表面钙富集的调控作用。该论文发表于《BIOMATERIALS RESEARCH》。

为开展研究，研究人员使用了来自猪松质骨的BHA颗粒（0.25–1 mm）和RAW 264.7小鼠巨噬细胞系（购自Procell）。关键技术方法包括：①构建2 mm均匀BHA颗粒层的直接共培养模型，并采用“预分离”法收集细胞后提取RNA；②利用反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和RNA测序（RNA-seq）分析基因、蛋白及转录组水平变化；③采用电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）检测钙富集能力，结合Zeta电位、扫描电镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、能谱分析（EDS）表征材料表面性质；④使用TLR4抑制剂TAK-242进行信号通路阻断；⑤通过DMEM循环孵育制备钙预吸附材料；⑥建立SD大鼠皮下植入模型（每组n=3），将材料植入双侧背部，3天后组织学评估巨噬细胞浸润。

### 区分了两种钙基微环境用于体外模型构建

通过ICP-OES发现，BHA在完全培养基中孵育24 h后上清Ca²⁺浓度显著下降，确认其表面具有强钙富集能力。基于钙分布差异，建立了间接培养（Extract组，钙缺乏环境）和直接培养（BHA组，钙富集表面）两种模型。光学显微镜显示1 mm厚BHA层存在颗粒间隙，细胞主要附着于培养基底；2 mm厚BHA层无可见间隙，SEM证实细胞在BHA表面有效附着。对比RNA提取方法发现，原位裂解法产物产量和纯度不足，而预分离法可有效回收高完整性RNA。RT-qPCR结果显示2 mm模型可上调Tnf-α、Il-1rn和Il-18表达，而1 mm模型与Extract组应答相似，表明充分细胞–材料接触是触发炎症所必需的，故后续采用2 mm模型。

### 羟基磷灰石的钙富集表面而非钙缺乏微环境触发巨噬细胞炎症反应

通过RT-qPCR检测促炎因子（Tnf-α、Il-6、Il-18、Il-1β、Il-1rn）和趋化因子（Ccl3、Ccl4）发现，BHA组在36 h时Tnf-α、Il-18、Ccl3、Ccl4表达显著上调，而Extract组与对照相比无变化或下调。ELISA结果同样显示，仅在BHA组出现TNF-α和MIP-1α水平升高。转录组分析中，BHA组富集免疫应答和炎症反应相关基因本体论（GO）条目，而Extract组未见此类富集，反而下调细胞周期、DNA复制修复相关通路。这些结果证实，BHA诱导的炎症主要由钙富集表面的直接接触驱动，而非周围钙缺乏微环境。

### BHA诱导TLR4信号通路激活与细胞内钙升高

京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集和基因集富集分析（GSEA）显示，BHA组显著富集Toll样受体信号通路。RT-qPCR证实BHA组TLR4相关基因（Tlr4、Cd14、Ly96）在36 h表达上调，而Extract组无明显变化。流式细胞术和荧光成像显示BHA组细胞内Ca²⁺水平显著升高。使用TLR4抑制剂TAK-242预处理后，TLR4相关基因及下游炎症因子Tnf-α、Il-1rn、Ccl3、Ccl4的表达显著降低，同时细胞内钙升高也被抑制，证明钙内流与TLR4依赖的巨噬细胞激活相关。不过，阻断TLR4后部分基因表达仍高于对照，提示可能有其他调控通路参与。

### 钙预吸附通过调控TLR4激活减弱BHA诱导的炎症反应

鉴于BHA表面机制与其钙富集行为密切相关，研究人员采用DMEM循环预吸附制备BHA(pre/3)和BHA(pre/6)。ICP-OES显示预吸附后BHA的钙富集能力呈循环次数依赖性下降，Zeta电位从?11.14 mV升至?8.60 mV和?7.51 mV，表面负电性减弱，而SEM、XRD、EDS未检测到形态、晶体结构和元素组成的改变。RT-qPCR显示BHA(pre)组TLR4相关基因表达下调，且炎症因子表达显著降低，其中Il-18在BHA(pre/6)组进一步下降。ELISA也显示TNF-α在两种预吸附组均降低，MIP-1α仅在BHA(pre/6)组显著减少。体内实验中，以全血或血清预处理BHA再行皮下植入，3天后炎性细胞浸润较未处理BHA组明显减少，其中BHA+全血组降低最显著。

综合讨论表明，BHA表面的钙富集行为导致表面负电性升高，进而激活TLR4信号；钙预吸附策略通过降低表面钙富集和调节表面静电特性，在不改变材料微观结构的前提下抑制炎症反应。该策略为开发低炎症骨替代材料提供了潜在方案，但预吸附表面在生理条件下的长期稳定性及其对成骨的影响仍需进一步研究，并需优化预吸附介质、处理循环数和临床转化方案。

**研究结论**：研究人员建立了针对颗粒状材料的体外直接培养模型和RNA提取策略，实现了完全的细胞–材料接触，并为下游分析提供了足量、高质量的RNA。BHA通过TLR4–钙信号通路激活巨噬细胞炎症，主要由钙富集表面的直接接触驱动，而非周围钙缺乏环境。钙预吸附有效降低了表面钙富集活性，同时保留BHA的微观形态，并减弱下游炎症反应。这些发现阐明了表面钙富集在羟基磷灰石诱导炎症中的关键作用，并为开发新型低炎症骨替代材料提供了潜在调控策略。