通过聚合物诱导液体前体形成的生物活性矿化细胞来源细胞外基质增强成骨和骨再生

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Bioactive Mineralized Cell-Derived Extracellular Matrix via Polymer-Induced Liquid Precursor Enhances Osteogenesis and Bone Regeneration

　　

有效的骨再生需要具有适当生物活性功能，尤其是骨传导和骨诱导特性的生物材料。在此，研究人员利用聚合物诱导液体前体(PILP)工艺，一种生成磷酸钙(CaP)矿化结构的有效策略，将细胞来源的脱细胞细胞外基质(cdECM)构建为新型矿化ECM支架。通过PILP矿化成功实现了cdECM内的矿物沉积，该过程稳定无定形前体相并促进基质相关矿化。所得矿化细胞外基质(mECM)表现出骨传导特性，这体现在良好的细胞相容性和成骨细胞增殖增强上。mECM还显示出骨诱导潜力，这通过小鼠前成骨细胞和人间充质干细胞中碱性磷酸酶活性增强、钙化增加以及成骨基因表达上调得到证实。此外，mECM促进了M2样巨噬细胞极化，并增强了内皮细胞的管状结构形成。为实现ECM源性生物信号和矿物的局部体内递送，研究人员使用透明质酸作为支撑基质制备了片状mECM支架，并通过戊二醛蒸汽交联进一步稳定。在小鼠颅骨缺损模型中，mECM片促进了新骨形成并支持晚期骨成熟，同时在早期伴随血管生成增强和以M2为主抗炎微环境的建立。总的来说，研究结果表明PILP矿化可成功应用于cdECM，以生成具有增强再生能力的生物活性mECM支架，代表了骨组织再生的有前景生物材料平台。

骨缺损修复是再生医学领域的重大挑战，其成功与否高度依赖于生物材料是否具备骨传导和骨诱导活性。细胞外基质(ECM)作为天然细胞微环境的重要组分，因其仿生组成和内在生物活性而被广泛用于骨组织工程；其中细胞来源脱细胞细胞外基质(cdECM)具有培养条件可控、脱细胞流程可重复等优点，但单纯cdECM缺乏足够的无机矿相。本研究针对这一瓶颈，提出将聚合物诱导液体前体(PILP)矿化策略应用于cdECM，制备兼具ECM生物信号和磷酸钙(CaP)矿相的新型矿化ECM(mECM)，并系统验证其体外成骨分化潜能和体内骨再生能力。该研究发表于《BIOMATERIALS RESEARCH》，为骨再生提供了具有转化潜力的复合生物材料平台。

研究人员首先从人脐带来源间充质干细胞(UCMSCs，来源于CEFObio)经体外培养和脱细胞处理获得cdECM，随后采用聚天冬氨酸(pAsp)介导的PILP工艺在优化条件下(10×浓度，孵育1周)制备mECM。表征手段包括傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)、扫描电子显微镜-能谱(SEM-EDS)和钙磷定量分析。体外功能评价使用小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和人间充质干细胞(hMSCs)评估成骨分化，使用RAW264.7巨噬细胞和HUVECs分别评估免疫调节和血管生成潜能。体内实验采用8周龄雌性ICR小鼠颅骨缺损模型，将mECM与透明质酸(HA)复合冻干并经戊二醛(GA)蒸汽交联制成片状支架，通过活体micro-CT、组织学和免疫荧光评估骨再生效果。

### mECM的表征

研究人员通过钙磷定量和形态学观察优化PILP矿化条件，确定10×浓度处理1周可获得均匀、稳定的矿物沉积，且ECM蛋白保留率最高。FT-IR谱中仅在mECM出现约1035 cm^?1处PO₄^3?特征峰；XPS和SEM-EDS检测到明显的钙、磷信号，Ca/P比约为1.34～1.4，表明矿物相为无定形磷酸钙(ACP)。mECM中矿物质约占其总质量的65.5%，而残留离子量极低。血管生成因子谱分析显示，mECM与未矿化ECM的整体因子分布大致相当，但TIMP-1、PDGF-AA等个别因子的水平有一定降低。

### mECM的生物相容性和细胞激活

通过LIVE/DEAD染色和CCK-8增殖实验，mECM和未矿化ECM均未表现出细胞毒性，且mECM显著促进了MC3T3-E1和hMSCs的增殖。在巨噬细胞极化实验中，mECM处理可上调M2型抗炎标志物Cd206和Arg1的表达，同时下调脂多糖(LPS)诱导的M1型促炎标志物Cd80和Nos2；mECM处理的巨噬细胞条件培养基还能显著增强HUVECs的管状结构形成能力，提示mECM具有促血管生成和免疫调节功能。

### mECM加速小鼠前成骨细胞成骨

在成骨分化诱导条件下，ARS染色显示mECM处理组从第11天即出现明显钙化结节，第21天时钙沉积量和ALP活性均显著高于未矿化ECM和空白对照组。RT-qPCR结果显示，mECM显著上调成骨相关基因Bglap、Spp1、Runx2、Alpl和Sp7的表达。在hMSCs中也观察到mECM加速钙化和增强ALP活性的现象，证实其骨诱导潜能具有细胞普适性。

### mECM片的制备与性能

为便于体内移植，研究人员将mECM与HA混合后冻干成片，并通过GA蒸汽交联提高结构稳定性。micro-CT显示mECM片内矿物分布均匀，而ECM片则基本呈射线可透性。GA交联后的mECM片在溶胀实验中于30分钟内保持形态完整，流变学测试显示其具有稳定的固态弹性行为(G′>G″)。MBTH法检测残留GA浓度仅为3.08～3.69 ppm，且细胞实验证实GA交联片无细胞毒性，说明交联后处理可有效去除残留试剂并维持生物相容性。

### mECM片增强体内骨再生

在小鼠颅骨缺损模型中，活体micro-CT显示mECM组在4周时已有大量新骨形成，8周时缺损几乎被新生骨完全桥接；骨密度(BMD)和骨体积分数(BV/TV)均显著高于未矿化ECM组和未处理组。组织学染色显示mECM组形成连续性成熟骨组织，骨细胞清晰嵌入骨基质；OCN免疫荧光信号面积显著增加，定量分析证实新骨面积、骨密度和OCN阳性面积均以mECM组最高。

### ECM和mECM片促进早期血管生成和促再生免疫反应

术后1周的组织分析显示，ECM和mECM植入部位可见明显新生血管，CD31阳性内皮细胞信号显著强于HA组；巨噬细胞标记物检测表明，ECM和mECM组均存在CD86阳性M1巨噬细胞和CD206阳性M2巨噬细胞浸润，但M2型细胞数量占优，提示早期形成了以抗炎和促修复为主的免疫微环境。

在讨论部分，研究人员指出UCMSCs因增殖能力强和ECM产量高而被选为细胞来源。PILP矿化通过负电荷聚合物稳定ACP前体，使其以液态无定形形式渗入ECM纤维并均匀沉积；ACP因较高的溶解性可释放钙磷离子，从而促进成骨。mECM保留了ECM内在的生物活性信号，同时引入CaP矿物组分，二者协同支持成骨、血管生成和免疫调节。GA交联虽然可能引入细胞毒性风险，但通过充分真空干燥可有效去除残留GA，使支架具备良好细胞相容性。研究的局限性包括未完全量化支架降解与新骨形成的同步性，以及未系统优化矿化含量对再生的剂量效应。结论部分总结指出，该研究成功将PILP矿化应用于cdECM，构建了可递送ECM源性生物活性因子和CaP矿物的新型mECM支架，其优异的体外成骨活性和体内骨再生能力表明这是一种有前景的骨组织再生生物材料平台。