利用GEMSTONE-TOCSY核磁共振波谱法对各种来源多糖的单糖组成进行直接高效分析

《Analytica Chimica Acta》：Direct and efficient analysis on monosaccharide composition of polysaccharides from various sources by GEMSTONE–TOCSY NMR spectroscopy

　　

摘要 核磁共振（NMR）波谱学是一种强大的波谱技术，能够实现分子结构解析和混合物组分分析的深入研究，尤其是在复杂混合物的鉴定方面。然而，常规1H NMR在测定和鉴定多糖水解体系中的碳水化合物时，通常存在共振峰拥挤的问题，因为该体系含有多种化学性质相似的化合物，甚至包括多种异构体单糖。本文描述了一种靶向检测NMR方法的应用，即梯度增强多重选择性靶向观测NMR实验（GEMSTONE-TOCSY），该方法通过在单独的1D NMR波谱中选择性靶向所需化合物，用于研究多糖水解混合物。我们使用GEMSTONE-TOCSY NMR对六种天然生物活性多糖水解模型混合物（包含11种单糖）和三个真实反应体系（槐树种子多糖、银耳多糖和水苏糖水解）进行了测试，结果显示该方法在单糖鉴定和结构分析方面表现良好，即使在常规1H NMR中质子信号拥挤和重叠的情况下也能胜任。此外，GEMSTONE-TOCSY NMR采用快速单次扫描方法，可选择性激发单个质子多重峰的信号，实现高效分析。结果表明，GEMSTONE-TOCSY NMR技术在分析和鉴定混合物体系中各种多糖的单糖组成方面稳健可靠，甚至可作为检测多糖水解过程的高效分析工具。

引言 多糖是由多个醛糖和/或酮糖通过糖苷键连接而成的生物大分子碳水化合物，主要存在于动物细胞、植物细胞壁和某些微生物细胞中[1], [2]。一般而言，源自天然产物的多糖表现出多种功能活性，如抗凝、抗氧化、抗动脉粥样硬化、免疫调节和抗肿瘤等作用[3], [4], [5], [6]。因此，由于其多样的生物活性、高安全性以及极少或无副作用，多糖已被广泛应用于生化、医药和食品工业。人们普遍认为，多糖的结构特征显著决定和影响其生物活性。作为多糖的基本单元，单糖不仅影响静电性质、官能团（如-COO-和-OSO??）和生物活性，还影响这些大分子的可溶性、流变性和稳定性[2]。这些性质是表征多糖的关键且必要的指标。例如，从黄芪水中提取物中分离的黄芪多糖（APS）具有不同的单糖组成（APS1仅由葡萄糖组成，APS2由阿拉伯糖组成，APS3由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成），显示出显著的免疫生物学活性和抗骨质疏松活性差异[7], [8]。这些生物活性多糖属于含有多种单糖单元的复杂化合物，全面分析并鉴定碳水化合物中涉及的所有化合物是研究生物大分子样品及其相关构效关系的重要步骤[9], [10]。

多糖单糖组成分析的传统技术包括气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）以及GC/HPLC-MS，这些方法基于化合物的物理分离[11], [12], [13], [14]。然而，由于大多数单糖缺乏天然紫外（UV）吸收发色团，这些方法存在一些不可避免的缺点和局限性。例如，HPLC方法通常需要特殊的折光率检测器或紫外检测器，而GC技术常用于监测衍生化样品[15], [16]。同时，在复杂体系中鉴定和分离结构相似的单糖（包括构造异构体，如葡萄糖和果糖，以及差向异构体，如葡萄糖和甘露糖，或葡萄糖和半乳糖）仍然是一项重大挑战。此外，每种单糖的异头形式（α和β）的存在进一步使分析复杂化。另外，GC和HPLC的性能也受到限制，因为多糖通常含有化学结构、分子量甚至异头物（α和β）相似的不同单糖化合物[17]。

溶液态核磁共振（NMR）波谱学作为一种常用的无损、定量分析工具，是有机分子结构解析的强有力方法，例如在天然产物发现和药物化学中，几乎所有实验室每天都在使用[18], [19], [20]。此外，与GC/LC-MS相比，NMR波谱学作为一种非侵入式、非破坏性的表征方法，不需要参考标准品，且可直接区分异构体和差向异构体。它还能提供复杂体系的原位信息，有效避免分析样品固有信息的丢失。然而，由于质子耦合，常规1H NMR通常面临谱图拥挤甚至信号重叠的严重限制和挑战，特别是在分析由大量成分和复杂分子结构组成的复杂混合物体系时[21], [22], [23]。因此，在能源、化学和生物科学领域，已开发出多种NMR方法来研究复杂样品体系并实现拥挤NMR谱图的解析[24], [25], [26]。基于此，可以推断NMR波谱学将可靠且适用于碳水化合物的结构测定和单糖组成分析，既可以单独使用，也可以与质谱和化学水解等互补技术配合使用。总体而言，1H NMR是最有用的分析方法之一，因其高天然丰度和灵敏度，被用于揭示多糖的精细结构和单糖组成。对于混合物分析，1H扩散有序NMR波谱学（DOSY）被认为是一种经典技术，它根据各成分的自扩散行为产生的扩散系数记录，对监测混合物中各成分进行光谱伪分离[27], [28]。值得注意的是，DOSY NMR的应用通常要求混合物体系中的成分具有不同的扩散系数（D），该系数已被用于探索混合物分析、发酵、生物质热解和分子量预测[29], [30], [31]。然而，在大多数多糖水解产物混合物体系中，类似化合物的D值接近且多重峰严重，导致给定二维平面中扩散域（F1）的信号重叠。三维NMR技术被提出用于获取与目标自旋体系相关联的全部NMR信号，从而通过在完整的二维1H-1H COSY或1H-13C HSQC平面上展开相关信号来解决该问题，从而减少信号重叠[32], [33]。纯谱NMR（Pure shift NMR）是一种新颖的高分辨技术，通过抑制同核耦合来消除1H-1H质子耦合，已被用于解析拥挤和重叠的信号[34], [35], [36], [37]。例如，开发的PSYCHE纯谱NMR方法可以与DOSY智能结合（PSYCHE-iDOSY）NMR，很好地克服了信号重叠和谱图拥挤的挑战，大大提高了谱图分辨率[38]。迄今为止，PSYCHE-iDOSY NMR技术已成功提供了生物质催化转化混合物和葡萄糖异构体混合物体系的分析，且无需任何预处理[27]。尽管在包括多糖水解在内的混合物体系组成和结构研究方面取得了显著成功，但二维和三维NMR方法通常需要数小时来获取和分析NMR数据，这是一个不可忽视的局限性。

为了实现对包含多种成分（如多糖水解产物中的单糖组成）的复杂混合物体系进行直接高效分析，利用快速谱图采集优势的一维NMR仍然是一种突出的策略。一般而言，一维NMR是一种通用的检测工具，因为它记录所有质子信号并提供详细的1H信息（如化学位移、J耦合和积分），从而使从众多重叠信号中提取所需数据成为可能[39]。然而，正是由于这一特点，使用常规一维1H技术对复杂体系的分析受到质子耦合和广泛信号重叠的严重限制。选择性一维TOCSY NMR是一种强大的技术，用于鉴定复杂混合物获得的拥挤质子谱图中的成分并进行结构归属[40]。事实上，一维TOCSY实验作为直接方法，通过选择性观测单个位点（1H共振）来关联每种化学物种的全部信号。然而，对于多糖水解产物，由于异常碳区域和同系物谱区经常出现的重叠多重峰，通常需要超越标准形状射频脉冲能力的选择性，因此常规选择性一维NMR直接表征单糖混合物样品是一项具有挑战性的任务。作为替代方案，化学位移选择性滤波器（CSSF）为该问题提供了有效的解决方案。虽然CSSF具有优异的选择性并提供了强有力的谱图简化，可产生单糖单元的子谱，但由于其实验时间长和设置复杂，CSSF并不是常用方法[41], [42], [43]。最近，一种稳健而强大的NMR方法——梯度增强多重选择性靶向观测NMR实验（GEMSTONE）被提出，该方法允许从复杂混合物重叠的多重峰组中选择目标质子信号，然后提供可识别的化学位移并实现化合物分离[44], [45]。实际上，GEMSTONE方法产生了与CSSF相同的选择性。与CSSF相比，GEMSTONE技术有一个新颖的脉冲序列元素，通过单次扫描进行快速超选择性激发来实现化学位移的连续空间编码，这使得目标信号可以从许多重叠的质子信号组中高效提取[46], [47], [48], [49]。具有良好分辨信号选择性和更好信噪比的GEMSTONE方法为用户提供了一个额外机会，帮助同时提取混合物体系中的多种化合物。新颖的GEMSTONE脉冲序列有潜力显著扩展靶向采集（如TOCSY实验）的适用范围。同时，新的GEMSTONE-TOCSY NMR实验已在使用一种抗生素和一种非对映异构体混合物（例如阿米卡星化合物以及（2S）-柚皮苷、（2R）-柚皮苷、（2R）-柚皮素苷和（2S）-柚皮素苷混合物）中进行了说明[44]。显然，GEMSTONE-TOCSY NMR在复杂混合物分析中显示出广泛的应用，甚至可用于监测化学反应过程。我们假设，针对天然来源多糖复杂单糖组成进行的高效率GEMSTONE-TOCSY NMR分析可以为多糖水解研究提供新方法，具有明确的化合物鉴定、靶向组分监测甚至转化反应检测功能，从而广泛应用于多糖水解研究。

本文探索了GEMSTONE-TOCSY NMR在生物活性多糖水解后单糖混合物研究中的独特应用，该混合物包含各种物理和化学性质相似的碳水化合物化合物。得益于强大的目标信号检测能力，GEMSTONE-TOCSY NMR可以从水解多糖混合物中选择性提取目标化合物，并单独提供其相应的干净子谱，这些子谱从拥挤的原始一维1H NMR谱中分离出来。我们制备了六个包含不同碳水化合物化合物的代表性模型混合物体系，如葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等，并直接对这些模型混合物进行GEMSTONE-TOCSY NMR分析，以揭示其单糖组成并对各组分的质子信号进行归属。在上述单糖中，这些单糖（葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖）是大多数多糖常见且重要的构成单元，在分子量和生物活性方面起着关键作用。最后，为了验证该分析技术的稳健性，GEMSTONE-TOCSY NMR被进一步应用于分析三个实时多糖水解反应混合物体系，以展示其在直接、高效分析多种单糖化合物方面的实际性能。

各章节摘要

化学品 用于上述混合物样品和多糖的化合物购自不同的化学公司。D-Glc（分析纯，99.5%）、D-Man（≥99%）、L-Rha（≥98%）、D-Gal（分析纯，99%）、D-Xyl（≥99%）、L-Fuc（≥98%）、D-Fru（分析纯，≥99%）、D-Rib（HPLC纯度≥99.5%）、L-Ara（分析纯，≥99%）、D-GlcA（≥98%）、D-GalA（≥97%）和三氟乙酸（TFA，分析纯，99.5%）购自阿拉丁试剂公司（上海）。水苏糖

GEMSTONE-TOCSY NMR波谱学性能 GEMSTONE-TOCSY NMR波谱学对多糖单糖组成分析和结构测定的适用性关键在于其检测选择性、谱图分辨率以及解决常规1H NMR谱图中信号重叠的效率。本文首先对由D-Glc和D-Fru组成的来自PCP水解产物的模型混合物进行了GEMSTONE-TOCSY NMR实验，以展示其区分拥挤和重叠质子信号的能力。

结论 综上所述，GEMSTONE-TOCSY NMR波谱学已成功应用于探索生物活性多糖水解的复杂单糖组成混合物，通过在单独的1D NMR谱图中靶向涉及化合物，该方法展现了作为复杂体系直接、高效组分分析和谱图归属的有意义NMR工具的价值。

共有九种不同的混合体系，其中包括一种果胶模型和三种真实的……水解反应体系。

CRediT作者贡献声明
Qi Zhao（赵琪）：撰写——审稿与编辑、监督、资源、资金获取、构思。Jiankai Huang（黄建开）：软件、调查研究、数据管理。Hui Ma（马辉）：撰写——初稿、方法论、调查研究、构思。Weibang Yu（余伟邦）：监督、资源。Yingxiong Wang（王英雄）：资源、构思。Kefeng Wu（吴可峰）：监督、资源。Weiguang Yang（杨维广）：方法论。Chao Luo（罗超）：调查研究、数据管理。Feifeng Pang（庞飞峰）：软件。Yan Chen（陈艳）：形式分析、数据管理

利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢
作者感谢广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515110234和2026A1515010077）、湛江海洋青年人才创新项目（2025R02105和2024R3007）、广东省医学科学技术研究基金（B2025135和A2025090）、湛江科技计划项目（2025A601010）、广东医科大学临床与基础研究专项（GDMUZDCG25023）以及广东医学（基金）的资金支持。

作者列表：
Hui Ma（马辉）| Jiankai Huang（黄建开）| Chao Luo（罗超）| Weiguang Yang（杨维广）| Yan Chen（陈艳）| Feifeng Pang（庞飞峰）| Weibang Yu（余伟邦）| Kefeng Wu（吴可峰）| Yingxiong Wang（王英雄）| Qi Zhao（赵琪）

单位归属：
中国广东省湛江市524003，广东医科大学，广东医科大学第二附属医院