饲喂枯草芽孢杆菌和酿酒酵母发酵葵花籽油粕对凡纳滨对虾生长性能、免疫应答和肠道菌群的影响

《Animal Nutrition》：Effect of feeding Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae-fermented sunflower oilcake on growth performance, immune response, and intestinal microbiota in Pacific white shrimp

　　

葵花籽油粕（sunflower oilcake, SF）因其高纤维含量和抗营养因子在水产饲料中的应用有限。微生物固态发酵（solid-state fermentation, SSF）可缓解这些限制，同时增强其营养和功能价值。本研究评估了微生物发酵葵花籽油粕（fermented sunflower oilcake, FSF）在太平洋白虾——凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）饲料中的应用潜力。研究采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，1 × 10⁹ CFU/mL）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，1 × 10⁸ CFU/mL）在中试规模发酵罐中于34 °C对商品葵花籽油粕进行发酵。共180尾初始体重为1.86 ± 0.01 g的凡纳滨对虾幼虾，分别投喂3种等氮饲料56 d：对照组（CON）、含2.5%未发酵葵花籽油粕饲料组（SF-2.5）和含2.5%发酵葵花籽油粕饲料组（FSF-2.5）。饲料分析表明，发酵提高了粗蛋白质和必需氨基酸含量，同时降低了粗纤维及单宁和皂苷等抗营养因子含量。与其他饲料组相比，投喂FSF-2.5饲料的对虾增重率和日生长系数（daily growth coefficient, DGC）显著升高，饲料转化率（feed conversion ratio, FCR）显著降低（P < 0.05）。FSF-2.5组的蛋白酶和淀粉酶活性也显著高于其他组（P = 0.001）。投喂FSF-2.5饲料的对虾超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活性同样显著升高（P < 0.05）。组织学检查显示，FSF-2.5组肝胰腺结构正常，肾小管完整，且具有充足的泡状细胞、纤维状细胞和吸收细胞。基于16S rRNA测序的肠道菌群分析显示，CON组对虾拥有最多的独有扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs；3116个），其次为FSF-2.5组（2684个）和SF-2.5组（1430个）。FSF-2.5饲料增加了肠道中潜在有益菌群如Fulvivirga、Ruegeria和Shimia的相对丰度，同时降低了致病性假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度（P < 0.05）。使用QIIME2插件中的带偏差校正的微生物组组成分析（analysis of compositions of microbiomes with bias correction, ANCOM-BC）对ASVs进行差异丰度分析，结果显示，与SF-2.5组相比，FSF-2.5组富集了有益菌微球菌属（Micrococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）。这些结果表明，FSF的作用不仅限于提供营养，还可作为肠道健康促进剂，并可被视为对虾养殖中一种可持续的功能性饲料原料。

凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）养殖在全球对虾产业中占有重要地位，但高养殖密度往往导致生长性能下降和免疫抑制。为缓解这一压力，功能性饲料原料受到越来越多的关注。葵花籽油粕（sunflower oilcake, SF）是成本较低的植物蛋白源，但由于粗纤维含量高并含抗营养因子（anti-nutritional factors, ANFs），其在虾饲料中的添加水平受到限制。微生物固态发酵（solid-state fermentation, SSF）可降低这些不利因素，同时提高底物的营养和功能价值。已有研究提示，发酵葵花籽油粕在鱼类中可改善矿物质利用，在鲑鱼中可降低炎症并促进肠道健康，但其对凡纳滨对虾生长、免疫及肠道菌群的系统评估仍不够充分。为此，研究人员以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对葵花籽油粕进行联合固态发酵，评估该发酵产物（fermented sunflower oilcake, FSF）能否作为功能性饲料成分，改善凡纳滨对虾的生长性能、消化能力、免疫状态和肠道健康。该研究发表在《Animal Nutrition》。

研究人员采用中试规模固态发酵罐，利用两种微生物在34 °C下发酵葵花籽油粕96 h制备FSF，并将180尾初始体重1.86 ± 0.01 g的凡纳滨对虾幼虾随机分为3个饲料处理组：对照组（CON）、2.5%未发酵葵花籽油粕组（SF-2.5）和2.5%发酵葵花籽油粕组（FSF-2.5），每组3个重复，饲养56 d。试验在印度ICAR-CIBA Muttukadu实验站开展，经机构动物伦理委员会批准。研究人员测定了饲料及虾体常规营养成分、抗营养因子、生长与饲料利用指标；检测了肝胰腺消化酶活性和血淋巴免疫参数，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、酚氧化酶（phenoloxidase, PO）和总血细胞数（total haemocyte count, THC）；进行了肝胰腺组织学检查；并利用16S rRNA基因V3–V4区高通量测序分析肠道菌群，结合QIIME2和ANCOM-BC插件进行差异丰度分析。

### 3.1 葵花籽油粕的固态发酵效果

成分分析表明，发酵产物中枯草芽孢杆菌和酿酒酵母数量分别达到9.34 × 10¹⁰ CFU/g和6.46 × 10¹⁰ CFU/g。与未发酵葵花籽油粕相比，发酵使粗蛋白质含量提高5.59%，粗纤维降低6.84%，单宁降低28.07%，皂苷降低65.09%，同时必需氨基酸含量增加。这说明双菌固态发酵能够有效改善葵花籽油粕的营养组成并降低抗营养因子。

### 3.2 生长性能和虾体生化组成

56 d饲养试验显示，投喂FSF-2.5饲料的对虾增重率（541.14%）和日生长系数（daily growth coefficient, DGC；2.34）显著高于CON和SF-2.5组，饲料转化率（feed conversion ratio, FCR）显著低于其他两组，蛋白质效率比（protein efficiency ratio, PER）也最高。CON和SF-2.5组的增重率和DGC差异不显著。所有处理组的存活率均高于90%，组间无显著差异。虾体生化组成中，除脂肪含量在FSF-2.5组显著升高外，其余指标无显著变化。

### 3.3 消化酶活性、免疫参数与肝胰腺组织学

消化酶活性测定显示，FSF-2.5组的蛋白酶和淀粉酶活性显著高于CON和SF-2.5组；脂肪酶活性在SF-2.5和FSF-2.5组均显著高于CON。免疫参数方面，FSF-2.5组的SOD和PO活性均显著高于其他两组，THC在组间无显著差异。肝胰腺组织学观察显示，SF-2.5组出现上皮脱落、泡状细胞膨大、纤维状细胞减少和吸收细胞增大等异常变化，而FSF-2.5组肝胰腺结构正常，肾小管完整，泡状细胞、纤维状细胞和吸收细胞充足。这说明FSF有助于提高消化酶活性、增强非特异性免疫并维持肝胰腺健康。

### 3.4 肠道微生物组成与差异菌群

16S rRNA测序共获得8874个扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）。CON组独有ASVs最多（3116个），其次为FSF-2.5组（2684个），SF-2.5组最少（1430个）。β多样性分析显示，SF-2.5组肠道菌群与CON组较接近，FSF-2.5组则形成相对独立的聚类并与另两组存在部分重叠。α多样性指数在组间无显著差异，但与SF-2.5组相比，FSF-2.5组的丰富度指数（Ace、Chao1和Fisher alpha）较高。在门水平上，FSF-2.5组中放线菌门（Actinobacteriota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）相对丰度高于其他两组，变形菌门（Proteobacteria）在SF-2.5组中最高。在科水平上，Rhodobacteraceae是各组主要优势科，FSF-2.5组的黄杆菌科（Flavobacteriaceae）和Saccharimonadales相对丰度升高，而Psychromonadaceae和Pseudoalteromonadaceae等降低。在属水平上，Fulvivirga、Ruegeria和Shimia等潜在有益菌在FSF-2.5组中富集，Pseudoalteromonas等机会病原类群丰度降低。ANCOM-BC差异丰度分析进一步显示，与SF-2.5组相比，FSF-2.5组显著富集了Peredibacter、微球菌属（Micrococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）。这表明FSF可调节凡纳滨对虾肠道菌群结构，促进有益菌群定植。

在讨论部分，研究人员将FSF组生长性能和饲料利用改善归因于发酵导致的抗营养因子降低和纤维结构改变，从而提高了营养物质的可利用性。与以往使用单一黑曲霉发酵的研究相比，本研究所用的枯草芽孢杆菌与酿酒酵母联合发酵可能产生了更多功能性成分，其本身也具有益生特性。虾体脂肪升高可能与植物性原料中无氮浸出物含量及为了配制等脂饲料而添加植物油有关。FSF提高消化酶活性，可能与发酵过程中微生物产生的胞外酶以及有益菌对宿主的协同作用有关。SOD活性升高可能与发酵释放的酚类等抗氧化物质有关；PO活性升高则可能与酿酒酵母来源的β-葡聚糖激活对虾β-葡聚糖结合蛋白，进而启动酚氧化酶原系统有关。肝胰腺组织学改善提示FSF未造成组织损伤。在肠道菌群方面，发酵可能通过有机酸尤其是丁酸调节肠道pH，抑制有害菌增殖；富集的放线菌门和疣微菌门可产生有益代谢物并改善肠道微生态；黄杆菌科成员可通过竞争抑制抵御致病性弧菌。富集的Ruegeria能合成维生素B12和抗菌物质，Micrococcus和Staphylococcus等产酶菌则可能增强消化能力；Pseudoalteromonas与对虾白粪病相关，其丰度降低有助于降低疾病风险。

研究结论可概括为：本研究证明了微生物发酵葵花籽油粕（FSF）作为凡纳滨对虾饲料功能性原料的潜力。按2.5%比例添加FSF不仅改善了生长性能和饲料利用，还提高了消化酶活性、免疫应答和肝胰腺健康。此外，FSF添加还调节了肠道微生物群，富集了放线菌门（Actinobacteriota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）以及Fulvivirga、Ruegeria、Micrococcus和Staphylococcus等有益类群，同时抑制了Pseudoalteromonas和Psychromonadaceae等机会病原菌。这些结果表明，FSF的功能超出其营养供给作用，可视为肠道健康促进剂，并可作为对虾养殖中可持续的功能性饲料原料。未来仍需要开展病原攻毒试验以及预防和治疗方案的进一步研究。