肉鸡胚胎对种蛋储存时长的生理反应：一项转录组学研究

《animal》：Physiological responses of broiler embryos to egg storage duration: A transcriptomics study

　　

产蛋后，种蛋在孵化启动前通常储存于育种场和孵化场。在某些情况下，种蛋储存时长超过7天，即所谓“长期储存”。长期储存与孵化率降低、孵化延迟以及出雏时雏鸡质量下降相关，但储存期间胚胎细胞层面的潜在过程尚未完全阐明。与以往针对单一通路的靶向研究不同，本研究采用全转录组分析（whole-transcriptome analysis）来探究肉鸡胚胎对种蛋储存时长的生理反应。研究人员比较了从新鲜种蛋（产蛋当日采集；n=10）及在18°C下储存4天（n=5）或14天（n=5）的种蛋中分离的肉鸡胚胎的基因表达水平。数据通过CLC Genomics Workbench平台进行分析。结果显示，4天储存和14天储存种蛋中肉鸡胚胎共有的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）与p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase, p38 MAPK）级联的正向调控相关，该通路在细胞应激下控制细胞生存与死亡之间的平衡。与新鲜种蛋胚胎相比，4天储存种蛋的胚胎显示出细胞周期阻滞于Gap 1到Synthesis转换（G₁/S转换）以及轻度内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ER stress）的基因表达特征。与14天储存种蛋的胚胎相比，4天储存种蛋的胚胎显示出活跃细胞增殖和修复轻微DNA损伤的基因表达特征。与新鲜种蛋胚胎相比，14天储存种蛋的胚胎同样显示出细胞周期阻滞于G₁/S转换的特征，并额外表现出氧化应激（oxidative stress）、细胞凋亡（apoptosis）、严重DNA损伤修复以及重度内质网应激的基因表达特征。当前发现表明，种蛋储存时长诱导胚胎从适应性应激反应（4天储存）转向适应不良性应激反应（14天储存），后者以氧化应激、细胞凋亡和严重细胞损伤为特征。本研究揭示了随着种蛋储存时长增加，囊胚后期活力下降背后的全转录组水平转变。

**论文解读：种蛋储存时长对肉鸡胚胎生理反应的转录组学研究**

种蛋储存是商业孵化场常见的操作流程，但储存时长超过7天会对孵化性能产生不利影响。研究表明，超过7天后每延长储存1天，孵化率下降0.5%，同时导致孵化延迟、雏鸡质量下降以及后期生长性能受损，造成显著的经济损失。然而，储存期间胚胎细胞内部发生的分子事件尚不明确。以往研究多聚焦于单一通路或单个应激因子，无法全面揭示储存时长对胚胎活力的影响机制。为此，Pennings等人采用全转录组分析方法，系统研究了不同储存时长下肉鸡胚胎的基因表达变化，试图从转录组水平解释长期储存导致胚胎活力下降的生物学基础。该论文发表于《animal》。

研究人员从单一肉鸡种鸡群（Ross 308，37-45周龄）收集产蛋当日种蛋，在平均17.7°C下分别储存4天或14天，并设置产蛋当日（OVI）对照组。每个处理组分别取5枚或10枚种蛋，分离胚胎后提取总RNA，利用Illumina NovaSeq6000平台进行链特异性RNA测序。测序数据经CLC Genomics Workbench 25.0质控、比对至鸡参考基因组GRCg7b1，并通过Wald检验鉴定差异表达基因（DEGs）。功能富集分析采用DAVID v6.8的基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路，同时结合Qiagen Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行上游调控子和调控效应网络分析。此外，还针对预设的细胞周期调控和细胞应激相关基因集进行了靶向分析。

**结果**部分包含以下分析内容：

- **差异表达基因概述**：研究共获得17亿条reads，平均每个样本6500万条。在全部比较中鉴定出3811个独特DEGs，其中OVI与4天储存（SS）比较有616个，OVI与14天储存（LS）比较有3521个，SS与LS比较有2467个。OVI与LS之间共有的DEGs富集于p38 MAPK级联的正向调控和RNA聚合酶II介导的转录负调控。14天储存对胚胎基因表达的影响远大于4天储存，表明储存时间延长激活或抑制了更多生物学过程。

- **产蛋当日与4天储存比较**：与OVI相比，SS胚胎中上游调控子APC及主调控子BBS2、TIRAP被预测激活。独特DEGs富集于RNA剪接调控、TORC1信号正调控、DNA损伤反应以及蛋白酪氨酸/丝氨酸-苏氨酸激酶活性。KEGG分析显示，发育相关Wnt信号通路下调，而线粒体自噬、内吞、自噬、Toll样受体信号和FoxO信号等细胞清除及应激反应通路上调。靶向分析发现6个DEGs，其中细胞周期调控基因呈现上调和下调并存，基因毒性应激和内质网应激相关基因上调，提示胚胎处于细胞周期阻滞和轻度内质网应激状态。

- **产蛋当日与14天储存比较**：与OVI相比，LS胚胎中上游调控子SPEN、MXD1、PHF12、RBL2和HDAC1被预测激活，而CKAP2L、ERBB2、CEBPB、MYC和RICTOR被预测抑制。独特DEGs富集于核糖体生成和蛋白质处理。KEGG分析显示，DNA复制、细胞周期和核糖体生物发生等增殖进程下调，而线粒体自噬、蛋白酶体、泛素介导蛋白水解和内质网蛋白加工等蛋白稳态和细胞清除通路上调。靶向分析的32个预设基因全部差异表达，表明细胞周期阻滞、氧化应激、基因毒性应激和内质网应激相关通路均被显著改变。

- **4天储存与14天储存比较**：与SS相比，LS胚胎中上游调控子KDM5B、FDFT1、IGF2和HDAC1被预测激活，而MYC、TFEB、N6AMT1、ERBB2和DELE1被预测抑制。SS中上调的DEGs富集于DNA复制和翻译等遗传信息处理过程，且定位于细胞核仁；LS中上调的DEGs富集于翻译后调控和蛋白稳态，且定位于细胞质。调控效应网络显示，LS中翻译、有丝分裂准备、Wnt信号和细胞架构相关基因下调，而DNA损伤、细胞周期调节、细胞凋亡和蛋白稳态破坏相关基因上调。KEGG分析进一步证实了这一趋势。靶向分析发现18个DEGs，其中氧化应激和基因毒性应激相关基因有上有下，细胞周期和营养应激相关基因仅在LS中下调，内质网应激相关基因仅在LS中上调。

讨论部分指出，细胞周期调控和细胞应激反应是储存时长影响胚胎活力的核心过程。与既往研究提出的G₂检查点阻滞不同，本研究发现4天和14天储存均诱导G₁/S转换阻滞，这种差异可能与储存温度和遗传背景有关。在14天储存胚胎中，氧化应激证据包括SAT1、MAPK8和MAPK9上调，以及SOD2、PRDX3等抗氧化基因下调；基因毒性应激表现为GADD45B/G上调，以及同源重组修复基因下调、非同源末端连接相关基因上调；内质网应激表现为HSPA5、PDIA4和HERPUD1上调，提示蛋白错误折叠和未折叠蛋白反应激活。未发现营养应激的证据。这些结果说明，4天储存胚胎启动适应性应激反应以维持存活，而14天储存胚胎则进入适应不良性应激反应，最终导致细胞凋亡和严重损伤。

研究结论可译为：可以得出结论，细胞周期调控和细胞应激反应是肉鸡胚胎中受种蛋储存时长影响的关键过程。4天储存种蛋的胚胎在储存期间表现出适应性应激反应，而这一反应在14天储存种蛋的胚胎中转变为适应不良性应激反应，其特征是氧化应激、细胞凋亡和严重细胞损伤。这些发现进一步表明，储存时长和温度的变化以及遗传背景可能影响这些反应的发生和严重程度，并可能有助于解释不同研究之间观察到的差异。