《Aquaculture Reports》：Transcriptome analysis reveals the response mechanism of Tomato hind (
Cephalopholis sonnerati) brain to RGNNV infection
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红点石斑鱼神经坏死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV）在番茄石斑鱼（Cephalopholis sonnerati）幼鱼中表现出高致病性，导致鱼类养殖业遭受重大损失。然而，番茄石斑
摘要翻译
红点石斑鱼神经坏死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV）在番茄石斑鱼（Cephalopholis sonnerati）幼鱼中表现出高致病性，导致鱼类养殖业遭受重大损失。然而，番茄石斑鱼对RGNNV感染的免疫互作机制尚不清楚。本研究利用健康和自然感染模型开展了病理学及转录组学分析。在感染个体中观察到严重的病理变化，包括神经元空泡化和细胞凋亡。转录组分析显示，RGNNV感染后上调基因占主导地位。参与免疫相关通路（JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作、NF-κB信号通路及坏死性凋亡）的基因转录水平在感染脑组织中显著上调，包括IL15、IL1R1、CXCR3、CXCL9、RIPK3、MLKL。对人工感染的脑细胞（TGB）的转录组分析进一步验证了功能富集的一致性。此外，抗病毒基因在感染的脑组织和脑细胞中均持续上调，如SAMD9L、TRIM25、IRF1、STAT1、TLR3、SOCS1。综上所述，这些发现表明，过度炎症激活、加剧的坏死性凋亡以及有限的抗病毒反应可能共同参与了RGNNV感染过程中的脑组织及细胞损伤。该研究为理解番茄石斑鱼的致病效应及宿主-病毒互作提供了有价值的参考数据，有助于制定针对RGNNV感染的有效防控策略。
论文解读
一、研究背景与目的
水产养殖为全球食品生产做出了重要贡献，然而细菌、病毒、真菌和寄生虫等传染性病原体对水产养殖发展构成重大威胁，可导致严重的疾病暴发和经济损失。石斑鱼是东南亚乃至全球范围内具有重要经济价值的养殖鱼类，而病毒性疾病的频繁暴发给石斑鱼产业造成了巨大经济损失。番茄石斑鱼（Cephalopholis sonnerati）隶属鲈形目（Perciformes）、鮨科（Serranidae）、九棘鲈属（Cephalopholis），主要分布于印度-太平洋的热带和亚热带海域，因其高营养价值、鲜艳的红色皮肤、优良的肉质以及野生资源稀缺性，已成为一种极具前景且具有重要经济价值的养殖品种。然而，气候变化给水生环境带来巨大挑战，随着水温升高，传染性鱼类疾病迅速蔓延。在感染石斑鱼科并导致高死亡率的病毒中，神经坏死病毒（nervous necrosis virus, NNV）是主要病原体。
NNV是一种高度传染性病毒，主要攻击鱼类的中枢神经系统，尤其是脑和眼睛，可导致病毒性神经坏死（viral nervous necrosis, VNN），又称病毒性脑病和视网膜病（viral encephalopathy and retinopathy, VER）。NNV感染的临床症状包括异常游动行为（螺旋游动、旋转或冲撞）、食欲减退和皮肤颜色异常。组织病理学分析显示，NNV感染的水生生物脑和视网膜出现广泛空泡化和神经退行性变，伴随中枢神经系统坏死。在NNV家族中，红点石斑鱼神经坏死病毒（red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV）是全球范围内最常见的基因型，能够感染多种硬骨鱼类，死亡率可达100%，尤其在多种鲈形目鱼类中危害严重。
尽管已在部分石斑鱼属（Epinephelus）物种中探索了针对NNV的免疫应答，但番茄石斑鱼对RGNNV的免疫响应仍完全未被探索。番茄石斑鱼虽属于石斑鱼家族，但其在九棘鲈属中的分类地位表明其具有独特的进化谱系，不同鱼种和属间对RGNNV的遗传基础和调控机制可能存在差异。为填补这一空白，转录组分析作为一种强有力的工具，能够促进宿主免疫相关基因及其在抗病毒防御中作用的鉴定。在山东省莱州进行的大规模育种过程中，NNV自然暴发导致番茄石斑鱼幼鱼大量死亡，造成相当大的经济损失。基于这一严重现象，研究人员开展转录组分析，以阐明RGNNV感染番茄石斑鱼的致病分子机制和抗病毒基因，为疾病防控和抗病品系选育提供参考。
二、主要技术方法
研究人员构建了自然感染模型，从患病和健康育苗池中分别采集番茄石斑鱼幼鱼脑组织样本，每组3个生物学重复，每个重复20尾幼鱼。通过PCR检测确认RGNNV感染并排除虹彩病毒（RSIV）。采用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学观察，透射电子显微镜（TEM）用于超微结构分析，TUNEL荧光染色检测细胞凋亡。对脑组织RNA进行Illumina NovaSeq X Plus平台双端测序，利用HISAT2比对到番茄石斑鱼参考基因组（GenBank assembly: GCA_043388425.1），DESeq鉴定差异表达基因（DEGs），筛选标准为|log2FoldChange|>1且FDR<0.05，并进行GO和KEGG功能富集分析。通过qRT-PCR验证12个代表性DEGs的表达可靠性。此外，利用人工RGNNV感染的TGB脑细胞（第57代，感染复数MOI=3.5，感染后12小时）转录组数据进行交叉验证。
三、研究结果
1. 番茄石斑鱼的病毒检测及行为、死亡率变化
NNV在孵化后第18天自然暴发，感染鱼表现出眼球增大、肤色加深和游动能力下降等典型临床体征，游动能力下降表现为头朝上、腹部朝上的螺旋游动以及协调性丧失。PCR检测确认为RGNNV感染并排除RSIV，对照组幼鱼健康且病毒检测阴性。
2. RGNNV感染导致显著的脑组织病理损伤
H&E染色显示，感染组脑组织出现明显空泡化、神经纤维严重损伤和神经元肿胀，而对照组无变化。TEM观察进一步确认感染组脑组织中存在大量神经元空泡化和细胞质空泡化，并观察到许多NNV样病毒颗粒聚集。TUNEL染色显示感染组绿色荧光信号明显多于对照组，表明RGNNV感染诱导了显著的细胞凋亡。
3. 转录组数据分析
构建了6个转录组文库（对照组C-1、C-2、C-3和感染组NNV-1、NNV-2、NNV-3），共获得1.14亿至1.75亿条原始读段，Q30范围为94.68%-95.43%，约98.61%-99.04%的原始读段质控后为clean reads，75.89%-84.62%的clean reads比对到参考基因组。
4. 差异表达基因分析
主成分分析（PCA）显示对照组和感染组明显分离，生物学重复聚类紧密。RGNNV感染诱导了1457个上调DEGs和86个下调DEGs，上调基因数量显著超过下调基因，表明RGNNV感染触发了脑组织更强的激活型转录响应。
5. DEGs功能富集分析
GO富集分析将DEGs分为90个GO条目，包括53个生物学过程（BP）、11个细胞组分（CC）和26个分子功能（MF）。在BP类别中，大量DEGs富集于细胞死亡、模式识别信号通路和免疫应答相关的多种功能通路。KEGG富集分析显示30条显著富集通路，主要涉及免疫系统、信号分子与互作、信号转导、细胞生长与死亡，包括病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的互作、抗原加工呈递、PPAR信号通路、NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作、TNF信号通路、凋亡和坏死性凋亡等。
6. RGNNV感染上调脑组织中的抗病毒和炎症反应
对JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作、NF-κB信号通路和坏死性凋亡4条代表性免疫相关通路的热图分析显示，关键基因显著上调：JAK-STAT通路中的JAK3、STAT1、STAT2；细胞因子-细胞因子受体互作中的CXCL9、CXCR3、IL15；NF-κB通路中的NFKBIA、RELB、IL1R1；坏死性凋亡中的RIPK1、RIPK3、MLKL。
7. qRT-PCR验证转录组数据可靠性
选取12个与抗病毒免疫和炎症反应密切相关的基因进行qRT-PCR验证，包括干扰素调节因子（IRF）家族基因（IRF1、IRF4、IRF8、IRF9）、干扰素刺激基因（ISGs）（ISG12、TRIM25、PKR、Mx）和白介素（IL）家族基因（IL15、IL34、IL3RB、IL12B），结果显示这些基因均高度上调，与RNA-seq结果一致。
8. RGNNV感染在TGB细胞中上调一致的免疫应答
将脑组织与人工RGNNV感染的TGB细胞转录组结果综合分析，共富集到15条共同KEGG通路，包括抗原加工呈递、Toll样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作、TNF信号通路、凋亡和坏死性凋亡等。共同DEGs热图显示，ISGs（SAMD9L、Mx、TRIM25）、IRFs（IRF4、IRF8）、细胞因子（STAT1、SOCS1、TLR3）等抗病毒基因在自然感染脑组织和人工感染脑细胞中均显著上调。
四、讨论与结论
讨论部分指出，RGNNV感染造成脑组织严重病理损伤，包括大量神经元空泡化和细胞死亡，与在其他硬骨鱼类中观察到的组织病理学特征一致。转录组分析揭示了感染脑组织中上调DEGs占主导地位，KEGG富集分析表明RGNNV触发了强烈的免疫激活，显著富集免疫防御、炎症反应和细胞死亡相关通路。研究还发现，过度炎症反应可能是导致脑神经炎症和细胞死亡的重要原因，IL15等促炎细胞因子的过表达会招募并激活T细胞和巨噬细胞，促进TNF-α等促炎细胞因子的释放。在细胞死亡机制方面，凋亡相关基因中内源性通路基因（Bax、Bcl-2、Caspase-9、p53）无显著变化，而外源性通路相关基因（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-7、TNF-α、Fas、FasL）显著上调，提示脑组织可能通过外源性通路介导凋亡以抑制RGNNV复制和传播。同时，坏死性凋亡关键调控因子RIPK1、RIPK3和MLKL显著上调，研究人员推测在RGNNV感染早期宿主可能通过调控凋亡限制病毒复制，而在感染后期RGNNV可能劫持宿主细胞利用坏死性凋亡通路促进自身复制和传播。
研究结论指出，本研究首次揭示了自然RGNNV感染可导致番茄石斑鱼幼鱼严重的脑部病理损伤和高死亡率。转录组分析表明，RGNNV可能触发过度炎症和广泛细胞死亡，自然和人工感染模型中炎症和坏死性凋亡相关通路基因的显著上调反映了这一现象。这些发现从生理和分子水平强调了RGNNV感染对番茄石斑鱼的深远影响，为理解石斑鱼病毒感染的分子机制提供了新信息，为VNN疾病防控和培育新的抗病品系提供了理论基础，增强了对水产养殖物种中RGNNV感染后宿主-病原体互作的理解。
