《Cell Systems》：High-throughput cell-free profiling of SARS-CoV-2 RBD variants enables rapid and quantitative in vitro affinity landscape mapping
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）变异株持续威胁公共卫生，因此有必要研究受体结合域（RBD）突变对抗体逃逸的累积效应和上位效应。研究人员提出了一种结合无细胞蛋白合成与微流控技术的高通量平台，用于定量评估覆盖从野生型到奥密克戎变异株进化空间的
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）变异株持续威胁公共卫生，因此有必要研究受体结合域（RBD）突变对抗体逃逸的累积效应和上位效应。研究人员提出了一种结合无细胞蛋白合成与微流控技术的高通量平台，用于定量评估覆盖从野生型到奥密克戎变异株进化空间的RBD三重突变体库与两种治疗性抗体及一种工程化结合蛋白之间的亲和力。通过快速的体外基因组装和无细胞合成，研究人员表达了518个RBD变体，并获得了31,740个定量亲和力测量值，从而构建了三张全面的结合能量图谱。该方法能够实现快速、大规模的体外亲和力分析及基于机器学习的预测，为研究新发变异株提供了有价值的工具。
**论文解读：SARS-CoV-2 RBD突变体的高通量定量亲和力图谱**
**一、研究背景与问题**
SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）的快速突变积累已导致针对中和抗体的显著免疫逃逸，其中治疗性抗体bamlanivimab（LY-CoV555）和imdevimab（REGN10987）是典型代表。尽管单位点突变的研究已较为深入，但由于序列空间庞大且残基间存在复杂相互作用，多点突变的组合效应仍难以解析。结合的稳定性依赖于多个相互作用的残基间的协同支撑，这使得孤立突变的研究不足以阐明逃逸机制。已有的高通量 assay 和机器学习研究虽然绘制了组合RBD突变的功能后果，但多局限于二元结合结果（结合/不结合），难以提供定量的亲和力变化。定量亲和力测量技术如表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉术（BLI）通量有限，成为制约突变图谱向定量预测转化的瓶颈。因此，亟需一种能够同时实现高通量和定量亲和力测量的新方法。
**二、研究内容与结论**
针对上述瓶颈，研究人员开发了一种结合无细胞蛋白合成与微流控技术的高通量平台（图1）。该平台利用全体外流程，在无需活细胞的情况下合成RBD变体蛋白，并通过微流控芯片实现大规模定量亲和力测量。利用这一平台，研究人员成功表达了518个RBD三重突变变体（覆盖野生型至奥密克戎之间的进化中间空间），并针对两种治疗性抗体（bamlanivimab、imdevimab）和一种工程化结合蛋白DBR3_03完成了31,740次定量亲和力测量，构建了三张全面的结合能量图谱。该研究展示了快速、大规模体外亲和力分析的可行性，并证明基于机器学习的序列-亲和力预测模型能够有效学习这些数据，为研究新发变异株提供了新的工具。论文发表在《Cell Systems》。
**三、主要关键技术方法**
研究采用了以下三个方面的关键技术。第一，使用**分段组装PCR**：将RBD基因划分为6个片段（126–283 bp），仅需50个不同基因块即可合成全部560个设计变体，显著降低合成成本。第二，应用**无细胞蛋白合成系统**：采用重组元素蛋白合成（PURE）系统，辅以二硫键增强剂（DsbC），实现RBD变体的高效表达与正确折叠，并以RBD-GFP融合蛋白形式固定于芯片。第三，使用**机械诱导分子相互作用捕获（MITOMI）微流控平台**：结合768单元室的微流控芯片，通过荧光检测和线性回归定量抗体与RBD变体间的相对亲和力。样本队列来源为本研究自主构建的RBD突变体文库。
**四、研究结果**
**1. 高通量定量亲和力图谱的构建**
研究人员设计了包含560个RBD三重突变变体的组合文库，其中每个变体包含3个选自奥密克戎RBD中16个高流行率突变位点的突变。通过分段组装方法，成功组装了518个变体（成功率92.5%）。MITOMI芯片系统通过768个反应室实现高通量测量，每个变体设置4个重复，每个抗体仅需3张芯片即可完成所有变体测量。针对全部3种结合蛋白，共获取31,740个亲和力测量值，展示了该平台获取大规模结合数据的能力。
**2. 单突变效应的定量分析与上位效应揭示**
通过计算“平均相对亲和力”来量化单位点突变在三重突变背景下的贡献。结果表明，bamlanivimab的结合主要受表位内的E484A和Q493R突变影响，并受到表位外S371L突变的增强。imdevimab的亲和力则被表位内外突变共同降低。DBR3_03对RBD表位突变具有较强耐受性，但S375F、T376A和D405N突变仍可影响其结合。值得注意的是，S375F和T376A同时降低了imdevimab和DBR3_03的亲和力，提示它们可能破坏了共享的结合区域。
**3. 上位效应与协同逃逸突变网络**
将每个双突变体的平均相对亲和力与其两个单突变体的加和预期值进行比较，可量化上位效应。对于imdevimab，E484A与S375F的组合表现出强协同效应，尽管E484A单独突变并非主要的逃逸突变，说明组合效应驱动了免疫抵抗。N501Y在单独存在时影响较小，但与S375F组合时显著放大亲和力损失，凸显了逃逸突变的背景依赖性。对于bamlanivimab，E484A与Q493R虽然各自独立降低亲和力，但组合后并无额外协同作用；而较弱的单突变R408S与E484A配对时却表现出最强的亲和力降低效应。构建的突变网络进一步揭示了抗体逃逸的热点区域：DBR3_03尽管总体抵抗力较强，但以S375F和T376A为中心存在潜在逃逸弱点；bamlanivimab的逃逸特征由E484A和Q493R的直接命中主导，并经由K417N、R408S和Q498R的失稳相互作用增强；imdevimab则更容易受到远离其初级表位的突变影响，N440K以及S375F+E484A协同组合可能通过远距离结构扰动而非直接位阻效应破坏其结合。三阶突变分析显示，S477N、T478K和Q498R的三重组合使bamlanivimab亲和力大幅降低（折叠变化=0.11），远超其任何双重组合的效果，表明存在非加和的协同放大效应。
**4. 统计检验与模型验证**
通过Friedman检验及后续Wilcoxon符号秩检验（Benjamini-Hochberg校正）确认，DBR3_03的平均相对亲和力显著高于bamlanivimab和imdevimab（p<0.001），而imdevimab与bamlanivimab之间无显著差异（p=0.32）。结构分析显示，DBR3_03通过紧凑的双螺旋支架结合RBD，依赖主链和侧链混合相互作用，而非仅广泛侧链接触，这降低了对抗原可变残基的依赖，从而解释了其对逃逸突变的高耐受性。研究人员进一步利用Elastic-Net模型对16个二元突变特征进行拟合，其负系数与平均亲和力分析中的表位残基高度一致，验证了这些残基效应的内在性。在预测模型基准测试中，跨抗体的最优模型在随机五折交叉验证中实现了0.75至0.86的Spearman相关性（图2F；表S8），表明大多数变异可归因于加和性突变效应。
**5. 机器学习预测与外部泛化能力**
研究人员对三种RBD序列表征方法（突变编码、one-hot编码、ESM2蛋白语言模型嵌入）和八种机器学习模型进行了系统基准测试，涵盖高斯过程（GP）、线性回归、岭回归、XGBoost、支持向量机（SVM）、多层感知机（MLP）、Elastic-Net和随机森林。在内部验证中，最优模型取得0.75–0.86的Spearman相关系数。ProteinNPT（一种基于Transformer的非参数模型）的性能与最优基线模型相当（Spearman相关系数分别为0.79、0.76和0.65），但未超越，表明在该局部奥密克戎突变景观中，高分辨率实验数据比复杂预训练表征更能驱动预测性能。在外部数据集泛化测试中，针对bamlanivimab的线性SVM（基于one-hot编码）在突变数≤5时仍保持0.81的Spearman相关性，而在突变数≤10时仍高于0.6；对imdevimab则预测能力有限，这种抗体特异性差异可能源于外部数据集与本研究在测量分辨率和灵敏度方面的差异。
**五、讨论与结论**
本研究所提出的完全体外化的高通量平台，通过结合体外基因组装、无细胞蛋白合成和微流控分子相互作用分析，能够快速建立全面的定量分子结合图谱，实现了对SARS-CoV-2 RBD突变体逃逸潜力的系统绘制。该方法可评估数百个蛋白变体和数万次测量，为实时监测新突变、预测抗体逃逸潜力和指导治疗性抗体设计提供了有力工具。尽管本研究聚焦于抗原突变文库，但相同的工作流程和建模框架可推广至其他可在无细胞系统中表达的粘合剂文库，如纳米抗体、单链可变区片段（scFvs）或计算设计的结合蛋白。随着该高通量流程产生的数据不断积累，基于序列的亲和力预测将进一步完善，从而加深对突变如何影响分子相互作用的理解，并推动更高效的计算模型开发。
**研究结论**：本研究成功实现了SARS-CoV-2 RBD变体的高通量定量亲和力测量，构建了三张覆盖野生型至奥密克戎进化空间的结合能量图谱，系统揭示了单突变效应、协同上位效应和抗体特异性逃逸热点。机器学习模型基于序列数据建立了定量亲和力预测框架，其中Elastic-Net可作为机械性指南标识关键逃逸驱动突变，而更高容量的模型有助于最大化预测能力。该平台为蛋白质工程和抗体设计提供了有力工具，对应对SARS-CoV-2等不断演化的病原体具有潜在的应用价值。
