《Applied and Environmental Microbiology》：Identification of beneficial bacterial strains for tomato growth promotion and biocontrol of bacterial canker caused by Clavibacter michiganensis
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摘要
由密执安棍状杆菌（Clavibacter michiganensis，Cm）引起的番茄细菌性溃疡病，由于缺乏有效的防治措施，至今仍难以控制。本研究对500余株细菌分离物进行了体外拮抗Cm活性及植物促生特性的筛选。基于上述结果，研究人员对32株候选菌进行了
摘要
由密执安棍状杆菌（Clavibacter michiganensis，Cm）引起的番茄细菌性溃疡病，由于缺乏有效的防治措施，至今仍难以控制。本研究对500余株细菌分离物进行了体外拮抗Cm活性及植物促生特性的筛选。基于上述结果，研究人员对32株候选菌进行了植株体内评估，最终鉴定出三株高效菌株：成团泛菌（Pantoea agglomerans）SO16PY，以及两株广义边缘假单胞菌（Pseudomonas marginalis sensu lato）菌株IRDA16和SO16PC，这三株菌能稳定促进番茄营养生长。值得注意的是，P. agglomerans SO16PY可将Cm接种植株的发病时间延迟长达7天，并显著降低枯萎严重度，使病情严重度评分从85%降至45%。菌株IRDA16和SO16PC同样能抑制病害发展，将严重度评分分别降至67.5%和57.5%。全基因组测序和比较基因组学分析揭示，菌株IRDA16和SO16PC在假单胞菌边缘种群（Pseudomonas marginalis group）内形成一个独特的、专门化的植物关联谱系，其平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）约为96%，数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization，dDDH）值约为69.5%，接近物种划分阈值。基因组挖掘鉴定出多个编码非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPS）、脂肽viscosin以及萜类化合物的生物合成基因簇，这些基因簇可能是该新型假单胞菌谱系兼具生物刺激与拮抗特性的驱动因素。综上所述，这些发现揭示了具有双重生物刺激和生物防治潜力的候选菌株，同时发现了一个在可持续农业中优化植物-微生物有益互作、基因组上显著分化的假单胞菌新谱系。
**论文解读：兼具促生与生防功能的番茄有益菌株筛选及其基因组学特征**
**一、 研究背景与目的**
番茄（*Solanum lycopersicum*）是全球消费量仅次于马铃薯的第二大蔬菜作物，2023年全球年产量达1.92亿吨。现代农业面临着在减少合成农化产品使用的同时，保障作物产量与品质的双重挑战。在此背景下，生物防治因其环境友好和可持续性，成为控制植物病害的重要策略。植物促生根际细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）作为一类重要的生物防治资源，既能通过解磷解钾、产吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、固氮、产铁载体及ACC脱氨酶活性等机制促进植物生长，又能通过竞争、诱导抗性、分泌次生代谢物等方式抑制病原菌。
由革兰氏阳性细菌密执安棍状杆菌（*Clavibacter michiganensis*，Cm）引起的番茄细菌性溃疡病是全球最具毁灭性的植物病害之一，被欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）列为A2类检疫性有害生物。该病自1910年在美国密歇根州首次报道以来，已广泛分布于世界各地，给番茄种植者造成重大经济损失。目前，针对该病的防治主要依赖化学手段，如铜制剂（波尔多液、氢氧化铜）、代森锰锌和链霉素等抗生素，但这些方法引发了环境污染、植物药害及病原菌抗药性等日益严重的问题。作为一种可持续的替代方案，PGPR被认为是有前景的生物防治制剂。然而，目前北美地区尚无关于分离自该区域、有效防治番茄细菌性溃疡病的有益菌株的报道，且不同PGPR的功能在不同气候条件下可能表现不一，本地适应性菌株通常具有更好的田间表现。因此，本研究旨在从北美（加拿大和美国）分离的细菌菌株中，筛选兼具植物促生（PGP）和抗Cm双重功能的候选菌株，并对优良菌株进行全基因组测序，以解析其促生与生防的遗传基础。
**二、 主要技术方法**
研究人员采用了一套循序渐进的筛选与鉴定策略。首先，对实验室保存的500余株细菌分离物进行体外（*in vitro*）拮抗Cm活性及PGP潜能（包括产铁载体、IAA、ACC脱氨酶活性、解磷解钾能力）的初筛，并对候选菌株进行16S rRNA基因测序鉴定。其次，在生长室内开展植株体内（*in planta*）促生效果评价，选用Trust和Heinz 2206两个番茄品种及两种土壤条件（100% PROMIX和70% PROMIX：30%沙），通过测量根、茎的鲜重和干重等指标评估促生效果。进而，通过种子萌发试验验证菌株对根系生长的促进作用，并利用无细胞上清液验证胞外抑菌代谢物的存在。在生防效果评价中，采用土壤浇灌方式在Cm接种前后对番茄植株进行菌株处理（priming和booster），通过病情严重度（DS）评分评估防效。最后，对筛选出的优良菌株进行Illumina NovaSeq 6000全基因组测序，结合多种生物信息学工具进行分析，包括ANI和dDDH计算、系统发育树构建、OrthoVenn直系同源蛋白簇分析、antiSMASH次级代谢物生物合成基因簇（BGCs）预测和PGPT-Pred促生功能基因注释。样本来源涵盖加拿大魁北克省及美国佛罗里达州和纽约州的苹果、梨、番茄、辣椒、茄子、洋葱、玉米、草莓和树莓等植物的土壤、叶、果等不同微环境。
**三、 研究结果**
**1. 菌株的体外筛选与鉴定**
通过对500余株候选菌的体外筛选，约250株显示出对Cm的可测量拮抗活性，抑菌圈面积介于103.8至881.4 mm2之间。进一步评估其PGP潜力后，共获得32株兼具体外PGP功能（如产铁载体、IAA，解磷解钾，ACC脱氨酶活性）的候选菌株。16S rRNA基因测序显示，这些菌株分属于假单胞菌属（*Pseudomonas*，65%）、泛菌属（*Pantoea*，12%）、伯克霍尔德氏菌属（*Burkholderia*，9%）、芽孢杆菌属（*Bacillus*，9%）和欧文氏菌属（*Erwinia*，3%）。其中，泛菌属分离株SO16PY展现出最大的抑菌圈（881.4 mm2）。
**2. 菌株的植株体内促生效果评估**
将32株候选菌在两个番茄品种（Trust和Heinz 2206）和两种土壤条件下进行促生效果验证。经重复实验验证，仅*Pantoea agglomerans* SO16PY及两株*Pseudomonas marginalis sensu lato*（IRDA16和SO16PC）能稳定且显著地促进番茄根和茎的生长参数。其中，SO16PY在贫瘠土壤条件下对两个品种的促生效果尤为突出；IRDA16和SO16PC则在标准PROMIX条件下对品种Trust的根茎生物量提升显著，SO16PC在贫瘠土壤下仍能改善茎生物量，显示出较强的环境适应性。
**3. 种子萌发试验与胞外抑菌代谢物验证**
种子萌发试验表明，三株菌对番茄种子萌发无负面影响，且均能显著促进种子初生根的伸长。将三株菌的无细胞上清液添加到Cm液体培养中，均能完全抑制Cm的生长，而阴性对照*Escherichia coli* DH5α的上清液无此效果。这证实了三株菌可通过分泌胞外扩散性抗菌代谢物来抑制Cm。
**4. 菌株对番茄细菌性溃疡病的生防效果**
在植株体内生防试验中，所有Cm接种的番茄植株均出现感病症状，但处理组症状明显减轻。*P. agglomerans* SO16PY预处理将发病时间延迟至接种后18-20天，相较于对照组的11-13天推迟了7天，并使最终病害严重度评分从对照的85%降低至45%，且植株仅表现为叶片边缘褪绿、未见萎蔫。*P. marginalis* IRDA16和SO16PC处理组的首发症状在15-17天出现，严重度评分分别为67.5%和57.5%，但萎蔫症状仍见于部分枝条。负对照组（无菌水处理）植株在整个实验期间保持健康。
**5. 全基因组测序与比较基因组学分析**
全基因组测序结果显示，SO16PY基因组大小为5.11 Mb，GC含量54.9%，编码4720个CDSs；IRDA16和SO16PC基因组大小约6.68 Mb，GC含量61.2%，各编码6100余个CDSs。基于ANI的系统发育分析证实，SO16PY与*P. agglomerans*模式菌株LMG 1286T聚为一支（ANI为98.3%，dDDH为89.1%）。而IRDA16和SO16PC与分离自小麦根际（MGMM3）和甜菜根际（ORh26）的两株*P. marginalis*形成一个独特的分支，其与*P. marginalis*模式菌株DSM 13124T的ANI（≈96.3%）和dDDH（≈69.5%，低于70%物种阈值）值接近物种界定边界。热图分析进一步表明这四个菌株可能属于一个独特的系统发育簇，暗示其可能代表一个新型植物关联谱系。OrthoVenn分析显示，IRDA16和SO16PC与MGMM3和ORh26共享397个在DSM 13124T中不存在的蛋白质，进一步支持其独特的基因组特征。
**6. 植物促生功能基因鉴定**
通过PGPT-Pred、PGAP和Bakta联合注释，在*P. marginalis*菌株中发现了参与铁载体（如NRPS依赖的pyoverdine和非NRPS依赖的hydroxamate型）生物合成的基因（*iucA/iucC*， *pvdS/pvdP*， *tonB*， *fur*），以及编码ACC脱氨酶的*acdS*基因。SO16PY则含有与desferrioxamine合成相关的*dfoA/dfoC*及铁摄取基因（*fhuA-F*）。三株菌均含有磷溶解相关基因*pqqA-F*和*gcd*。对于IAA合成，SO16PY含有吲哚丙酮酸途径的关键基因*ipdC*；而*Pseudomonas*菌株仅检测到吲哚乙酰胺途径的*iaaM*，缺乏*iaaH*，这与体外未能检测到IAA产生的结果相符。
**7. 次级代谢物生物合成基因簇鉴定**
antiSMASH分析在SO16PY基因组中鉴定出desferrioxamine E、frederiksenibactin（一种金属载体）、 aryl polyene色素和phenazines的生物合成基因簇。在IRDA16和SO16PC基因组中则鉴定出多个未知NRPS、脂肽viscosin以及萜类化合物（如sodorifen）的生物合成基因簇。值得注意的是，这些viscosin、萜烯、thanamycin等基因簇均不存在于*P. marginalis*模式菌株DSM 13124T的基因组中。
**四、 讨论与结论**
本研究通过体外与体内相结合的双重筛选策略，成功鉴定出三株兼具促生和生防功能的多功能菌株。研究结果证实，*P. agglomerans* SO16PY不仅能促进番茄生长，还能显著延迟细菌性溃疡病发病并降低病害严重度，展现出作为PGPR制剂的巨大潜力。而*P. marginalis* IRDA16和SO16PC虽然生防效果略逊于SO16PY，但其促生效果和对不同土壤条件的适应性差异表明，它们可能更适合作为综合防治策略的组成部分。
一个核心发现是，基于全基因组系统发育和基因组相似性分析，菌株IRDA16、SO16PC与MGMM3、ORh26共同构成一个与经典致病谱系明确分离的新型植物关联谱系。尽管其ANI值（≈96%）仍处于*P. marginalis*物种界限内，但处于临界值的dDDH（≈69.5%）、系统发育树上的稳定分离以及397个特有蛋白簇的存在，强烈提示这可能是正在经历遗传分化、专门适应于有益植物互作的新型假单胞菌物种。该谱系的菌株分离自北美、欧洲和欧亚大陆等地理上相距遥远的地区，表明其分布范围可能比目前认识的更为广泛。这种生态适应性可能与其作为生物防治剂的潜力密切相关。基因组分析发现，该谱系独有地拥有编码viscosin和萜烯等次级代谢物的BGCs，这些化合物已知与根际定殖、促生和植物防御有关，可能在其有益植物关联生活方式中发挥了关键作用。
本研究的研究结论明确指出，所鉴定出的三株细菌（*P. agglomerans* SO16PY和*P. marginalis* IRDA16、SO16PC）在促进番茄生长和防治细菌性溃疡病方面展现出双重功能，是可持续农业中替代化学投入品的有力候选者。此外，研究还发现了一个基因组上独特的假单胞菌新谱系，丰富了人们对有益植物-微生物互作进化机制的理解。未来的研究应致力于阐明其生防的确切分子机制，开发有效的微生物菌群，评估其在多样化田间条件下的表现，并优化应用方法以最大限度地发挥其农业应用潜力。
