感染性脾肾坏死病毒（ISKNV）在神仙鱼（Pterophyllum scalare）中的排毒动力学与感染阶段依赖性水平传播

《Animals》：Shedding Kinetics and Infection Stage-Dependent Horizontal Transmission of Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus (ISKNV) in Angelfish (Pterophyllum scalare)

　　

简洁摘要
感染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）是巨细胞病毒属（Megalocytivirus）成员，因其宿主范围广且能在环境中持续存在，对观赏鱼和水产养殖业构成威胁。本研究探讨了ISKNV在神仙鱼（Pterophyllum scalare）中的感染动态及阶段依赖性水平传播。浸泡攻毒实验表明，神仙鱼对ISKNV感染高度易感，在10⁶ TCID₅₀/mL浓度下累积死亡率达95%。估算的半数致死量（LD₅₀）和半数感染量（ID₅₀）表明，即使在亚致死病毒浓度下也可发生感染。病毒载量在浸泡后第7天达到峰值，并与脾脏和肾脏组织病理学病变的严重程度呈正相关，包括多灶性坏死和嗜碱性细胞增大。为评估水平传播，研究人员将 na?ve 鱼在不同感染阶段与感染供体鱼共居24小时。研究结果表明，ISKNV传播可在短期共居后发生，且在所检测的实验条件下，传播结果可能因供体鱼的感染阶段而异，这为了解ISKNV传播动态及其对观赏鱼产业疾病管理的潜在影响提供了见解。

ISKNV在神仙鱼中的感染动态与传播机制：研究背景、技术方法及核心发现

**研究背景与目的**

观赏鱼国际贸易的持续增长推动了全球观赏鱼产业的经济发展，但同时也加剧了病原体跨国界传播的风险。巨细胞病毒属（Megalocytivirus）成员作为鱼类病毒中具有显著经济与生态影响的病原，对观赏鱼及食用鱼养殖系统造成了严重威胁。感染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV）属于虹彩病毒科（Iridoviridae），为直径120–200 nm的二十面体DNA病毒，具有单一线性双链DNA基因组。根据国际病毒分类委员会（ICTV, 2024）的分类标准，Megalocytivirus属现分为Megalocytivirus pagrus I和Megalocytivirus lates I两个种，主要基于主要衣壳蛋白（major capsid protein, MCP）和三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase, ATPase）基因的序列一致性。ISKNV宿主范围广泛，可感染近50种淡水、半咸水和海水鱼类，在观赏鱼贸易中已实现全球范围传播。水平传播，尤其是通过污染水体的传播，被认为是养殖系统中ISKNV扩散的主要途径。感染鱼在急性感染期可向周围环境释放大量病毒颗粒，显著增加了向na?ve鱼群传播的风险。然而，有关观赏性淡水鱼类病毒排毒动力学和阶段依赖性传播动态的定量信息仍然有限，这凸显了深入理解水体传播机制以制定有效生物安全防控策略的必要性。

神仙鱼（Pterophyllum scalare）是全球观赏鱼贸易中进口和分布最广泛的物种之一，已被认定为ISKNV的易感宿主，多个国家均有自然感染报道。尽管如此，有关该物种对ISKNV的致病性及实验性水平传播潜力的系统数据仍十分匮乏。本研究旨在利用浸泡感染和短期共居模型，评估淡水条件下ISKNV在神仙鱼中的感染动态，具体目标包括：（1）确定浸泡暴露后ISKNV对神仙鱼的剂量依赖性致病力和感染性；（2）表征感染组织中病毒的时序复制动态及伴随的组织病理学进展；（3）定量病毒排毒水平并评估短期共居期间的阶段依赖性水平传播，从而为观赏鱼产业的疾病管理提供科学依据。

**技术方法概述**

研究人员以实验室驯养的健康神仙鱼（平均体长4.8 ± 0.71 cm；平均体重1.79 ± 0.79 g）为实验对象，采用2024年从新加坡进口至韩国的矮鲈（Trichogaster lalius）中分离的ISKNV毒株DGIV-SAY-23（GenBank登录号OR822346）进行攻毒实验。病毒在矮鲈鳍条细胞系中增殖培养。主要技术方法包括：（1）剂量依赖性浸泡感染实验：将神仙鱼暴露于10²至10⁶ TCID₅₀/mL五个浓度的ISKNV悬液中2小时，观察21天死亡率以估算半数致死量（LD₅₀）和半数感染量（ID₅₀）；（2）时序感染动态分析：以10⁵ TCID₅₀/mL浓度浸泡感染后，于第3、5、7、10和14天采集脾脏和肾脏组织，采用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）测定病毒载量，同时进行组织病理学评分；（3）阶段依赖性水平传播实验：将na?ve受体鱼与感染供体鱼在不同感染阶段（3、7、10天）共居24小时，随后分离饲养，监测28天累积死亡率；（4）水体病毒定量：采用铝絮凝法浓缩养殖水体中的病毒颗粒，结合qPCR定量排毒水平。

**研究结果**

**3.1 剂量依赖性浸泡感染与死亡率**

浸泡攻毒实验结果显示，神仙鱼对ISKNV表现出高度易感性。10⁶、10⁵、10⁴和10³ TCID₅₀/mL组的累积死亡率分别为95%、80%、40%和5%，而10² TCID₅₀/mL组和阴性对照组均无死亡。经四参数逻辑回归模型拟合，ISKNV浸泡感染的LD₅₀估算为10^4.25 TCID₅₀/mL（R² = 0.9647）。ID₅₀估算为10^3.17 TCID₅₀/mL，较LD₅₀约低10倍，表明在亚致死病毒浓度下即可建立感染。qPCR分析显示，感染率和病毒基因组拷贝数均呈浓度依赖性增加：10²和10³ TCID₅₀/mL组的感染率分别为15%和35%，而10⁴、10⁵和10⁶ TCID₅₀/mL组的感染率分别升至95%、100%和100%。

**3.2 时序感染动态**

病毒载量在感染期间持续上升，于第7天达到峰值。第3天病毒载量为8.36 × 10⁴ copies/mg，随后持续增加，第7天达到8.28 × 10⁹ copies/mg的峰值。第10–14天病毒载量略有下降，至第14天降至9.78 × 10⁸ copies/mg，较峰值约降低9倍。

**3.3 组织病理学进展与病毒复制的关联**

组织病理学评估显示，第3天脾脏中仅观察到黑色素巨噬细胞中心（melano-macrophage centers, MMCs）的激活，无ISKNV特征性病变，评分为1。第5天脾脏和肾脏出现增生的嗜碱性细胞，评分升至2。第7天观察到最严重的病变（评分4），表现为脾脏和肾脏组织中大量增生性嗜碱性细胞和坏死性病变，与病毒载量峰值（8.28 × 10⁹ copies/mg）相一致。第10和14天脾脏中肥大细胞数量减少，组织病理学等级降至3（中度），与病毒载量下降平行。相关性分析显示，病毒载量与组织病理学等级呈显著正相关（r = 0.7258，p < 0.01）。

**3.4 短期共居后的阶段依赖性水平传播**

共居传播实验显示，供体鱼在25 dpc（days post-cohabitation）时累积死亡率达80%。与第3天供体鱼共居的受体鱼在28 dpc期间无死亡；而与第7天和第10天供体鱼共居的受体鱼累积死亡率分别为80%和60%，首次死亡分别出现在7和14 dpc。病毒载量分析确认所有受体鱼组在24小时共居后均发生ISKNV传播，但感染程度因供体鱼感染阶段而异。与第3天供体鱼共居的受体鱼虽无死亡，但存活鱼均为轻度感染；与第10天供体鱼共居的受体鱼在死亡个体中检测到最高病毒载量，达4.42 × 10⁷ copies/mg。水体病毒定量显示，供体鱼排毒水平随感染进程升高，第10天达到最高浓度1.63 × 10⁶ copies/L/g。较高的水体病毒载量（第7和第10天）与相应受体鱼组较高的累积死亡率相吻合。

**讨论与结论**

本研究表明，神仙鱼对ISKNV浸泡感染高度易感，在淡水、28°C条件下表现出急性死亡模式。值得注意的是，ID₅₀比LD₅₀约低10倍，表明ISKNV感染可在低于诱导显著死亡的病毒浓度下发生，提示感染与死亡应作为独立指标分别评估。与既往采用腹腔注射模型测定ID₅₀的研究不同，本研究提供了浸泡暴露可成功建立ISKNV感染的实验证据，强调了水体传播在养殖系统中的潜在重要性。病毒载量与组织病理学严重程度在时间上高度一致，第7天达到峰值后逐渐下降，可能反映了宿主免疫应答的激活。水平传播实验中，仅24小时共居即可实现ISKNV传播，且传播效率与供体鱼的感染阶段密切相关，较高排毒水平对应较高的受体死亡率。研究存在一定局限性，包括时序感染实验和共居处理均使用单一实验缸，个体鱼和水样不构成独立实验重复，结果应在特定实验条件下解释。总体而言，这些发现证明了在实验条件下，供体鱼的感染阶段与ISKNV在神仙鱼中的病毒排毒和水平传播相关，短期共居即可发生传播，这对观赏鱼产业的疾病管理具有潜在的现实意义。