利用嗜乙醇梭菌增强乙醇生产的策略：来自单底物与共底物发酵的启示

《Biomass and Bioenergy》：Strategies to enhance ethanol production using Clostridium autoethanogenum: Insights from sole- and co-substrate fermentation

　　- 纯CO发酵在乙醇合成方面优于合成气发酵。- 合成气-木糖共发酵提高了生物量但未提升乙醇产量。- 补充甲酸钠激活了Wood-Ljungdahl途径的甲基支路。- 精确的pH控制对于防止甲酸同化过程中的抑制至关重要。- CO与甲酸共发酵协同提高了生物量和乙醇产量。**引言**生物乙醇是传统化石燃料的清洁可再生替代燃料，可由可持续生物质原料生产。木质纤维素生物质的乙醇生产通常通过三种平台路线之一进行：糖类平台、羧酸盐平台和热化学平台[1]。糖类平台通过预处理、水解和发酵将碳水化合物（如玉米秸秆或能源草）转化为乙醇[2,3]。羧酸盐平台利用微生物（包括梭菌属和酵母）将生物质转化为羧酸盐，再进一步加工为生物乙醇[4,5,6]。然而，糖类平台和羧酸盐平台均受到有效利用木质素能力的限制，而木质素是生物质的关键组成成分。相比之下，热化学平台通过气化或热解将全部生物质原料（包括木质素组分）转化为合成气（主要为CO、CO?和H?）[7]。随后对该合成气进行厌氧发酵可生成乙醇，同时具有高碳捕获和整体能效的优势[8,9,10]。这种固有的灵活性使热化学平台成为可持续生物乙醇生产的有前景且可扩展的路线。尽管前景广阔，合成气发酵仍面临重大工程挑战，包括因CO和H?溶解度低导致的气液传质限制、惰性气体（N?和CH?）的稀释效应，以及反应器设计方面的限制，如气体停留时间和传质系数[8]。本研究未直接解决这些工程问题，而是侧重于通过代谢策略在批次水平上提高乙醇产量，同时未来放大研究应系统评估这些因素。产乙酸菌包括林格氏梭菌（*Clostridium ljungdahlii*）、羧酸梭菌（*Clostridium carboxidivorans*）、拉格斯代尔梭菌（*Clostridium ragsdalei*）、自产乙醇梭菌（*Clostridium autoethanogenum*）和科斯卡蒂梭菌（*Clostridium coskatii*），可通过Wood-Ljungdahl途径（WLP）将一碳气体转化为乙酸和乙醇[11,12,13,14,15]。这些菌株表现出代谢灵活性，可在CO、CO?上自养生长或在糖类上异养生长（图1）。在WLP中，CO或CO?被固定形成乙酰辅酶A；另一种方式是通过糖酵解代谢糖类形成丙酮酸，丙酮酸可通过脱羧反应转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A用于合成生物量及其他代谢产物，如乙酸或乙醇。WLP包括两个支路：甲基支路和羰基支路。如图1所示，CO?在羰基支路中被还原为CO，在甲基支路中通过一系列反应被还原为甲基。随后，甲基、来自CO的羰基和辅酶A通过缩合反应形成乙酰辅酶A。尽管产乙酸菌代谢灵活，但气发酵中的细胞质量和产物浓度仍然有限。此外，热力学上乙酸相对于乙醇更有利，这限制了乙醇产量，对商业化生产构成挑战[8,16,17]。提高乙醇产量的策略包括pH调节、氨基酸补充和碳源改良[11,13,18,19,20]。共底物投喂（如将C?气体与糖类结合）可促进产乙酸菌的混合营养生长，在林格氏梭菌（*C. ljungdahlii*）、热乙酸球杆菌（*Moorella thermoacetica*）和*C. scatologenes*中均有观察[21,22,23]。该方法可通过糖酵解产生额外的ATP和还原当量，有利于生成乙醇等还原产物。选择木糖作为糖类共底物，原因是其来源于木质纤维素、已证明在CO条件下与自产乙醇梭菌（*C. autoethanogenum*）兼容[11]，且能为乙醇合成提供NADH；其相对于葡萄糖或阿拉伯糖的偏好性较低，也使其成为研究混合底物发酵中碳利用效率的合适模型。其他有前景的C?底物包括甲酸和甲醇，它们比气体更易于运输、储存，且溶解度更高，从而减轻了传质限制[23,24,25]。它们可作为额外的电子供体，支持生长，且所需能量低于H?/CO?[26,27,28]。由于甲酸合成是WLP甲基支路的初始步骤，补充甲酸可减少还原当量的需求，从而促进生长和酒精产量，这一点已在林格氏梭菌（*C. ljungdahlii*）PETC和羧酸梭菌（*C. carboxidivorans*）P7中得到证实[29]。然而，在产乙酸菌中极少观察到以甲酸为唯一底物的利用现象[30,31]，且可能引入pH变化、甲酸形态变化、钠负荷和渗透压胁迫等限制，所有这些都要求精细的工艺控制。尽管甲酸钠补充已在相关产乙酸菌（如林格氏梭菌（*C. ljungdahlii*）PETC和羧酸梭菌（*C. carboxidivorans*）P7）中得到研究[29]，但其对自产乙醇梭菌（*C. autoethanogenum*）的影响仍鲜有探索。迄今为止，在自产乙醇梭菌（*C. autoethanogenum*）单一背景下评估多种底物策略（包括合成气-木糖共发酵、纯CO发酵、甲酸补充和CO-甲酸共发酵）的研究十分有限。本研究中，乙醇浓度（滴度，g/L）和乙醇与乙酸比（mol/mol）被用作主要性能指标，前者与其对下游回收成本的相关性有关，后者作为溶剂生成转变的指示器，这是气发酵中的一个关键瓶颈。产量和生产率未在策略间进行系统比较，因为实验是在不同的反应器系统（气体采样袋、STR和血清瓶）中进行的，使得直接速率比较本质上不公平。**各节片段****微生物与培养基**自产乙醇梭菌（*C. autoethanogenum*）DSM 10061购自德国菌种保藏中心（DSMZ，德国布伦瑞克）。培养基为先前描述的配方的改良版本[32,33]。基础培养基每升包含以下成分：10 mL**矿物质溶液**（80 g/L NaCl，100 g/L NH?Cl，10 g/L KCl，10 g/L KH?PO?，20 g/L MgSO?·7H?O，4 g/L CaCl?·2H?O）；10 mL**微量元素溶液**（2 g/L 亚氨基三乙酸，1.3 g/L MnCl?·4H?O，0.2 g/L CoCl?·6H?O，0.2 g/L ZnSO?·7H?O，0.4 g/L ...**合成气或CO作为底物**研究了以人工合成气或纯CO作为唯一碳源和能源培养自产乙醇梭菌（*C. autoethanogenum*）的代谢行为。人工合成气富含H?，含有CO、CO?、CH?以及微量C?H?、C?H?和C?H??。气体消耗量和生成量根据初始和最终阶段的顶空体积和组成计算。如表1所示的结果显示了不同的底物利用模式。在合成气发酵过程中，CO被...**结论**本研究通过合成气-木糖共发酵、纯CO发酵、甲酸补充以及CO和甲酸钠共发酵，探究了提高自产乙醇梭菌（*C. autoethanogenum*）代谢性能的策略。纯CO发酵的乙醇与乙酸比（1.30 mol/mol）高于合成气发酵（0.60 mol/mol），与基于CO的反应的热力学优势一致。合成气-木糖共发酵使生物量增加了2.8倍，但受到缓慢的...限制。**CRediT作者贡献声明****刘云芸：**撰写——初稿。**王钰晶：**调查、数据管理。**方崇：**资源、方法论、数据管理。**许慧娟：**撰写——审阅与编辑、验证、概念化。**郭英：**撰写——审阅与编辑。**利益冲突声明**作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。**致谢**本工作得到陕西省重点研发计划（2026SF-YBXM-074）、国家重点研发计划（2019YFB1503904）和国家自然科学基金（52476230）的支持。刘云芸|王钰晶|方崇|许慧娟|郭英