三基因敲除的异种骨修复材料通过调节抗原-免疫-炎症轴，实现了骨修复免疫微环境与骨再生的协同优化

《Biomaterials》：Triple Gene-Knockout Xenogeneic Bone Repair Material Achieves Synergistic Optimization of Bone Repair Immunomicroenvironment and Bone Regeneration via Antigen-Immunity-Inflammation Axis Modulation

　　摘要
骨缺损修复面临着复杂的免疫排斥微环境和骨生成能力受损的双重挑战，这严重限制了异种骨移植材料的临床应用。异种抗原（α-Gal、Neu5Gc和SDa）与宿主免疫系统之间的动态相互作用形成了“抗原-免疫-炎症”联盟，激活了补体级联反应，招募免疫细胞浸润，并驱动促炎性巨噬细胞的极化，从而引发慢性炎症和纤维化。至关重要的是，这种促炎性微环境是骨生成失败的关键决定因素。因此，重塑骨修复的免疫微环境可能从根本上改变这一现状。在这项研究中，我们构建了一种经过三重基因编辑和Urist处理的异种脱钙骨基质系统（3KODBM）。通过结合基因编辑敲除主要异种抗原基因（GGTA1、CMAH和B4GALNT2）与Urist方法去除残留抗原表位的策略，我们有效降低了免疫排斥。此外，我们还将基因编辑与物理化学修饰相结合，协同重塑免疫微环境，促进M1型向M2型巨噬细胞的极化，并释放TGF-β等骨生成因子，从而促进骨修复。研究结果表明，3KODBM显著下调了IL-17A/RORγt炎症通路，减少了纤维化，并显著促进了Runx2和Osterix等骨生成标志物的表达。通过抗原基因敲除建立免疫排斥“制动器”，并通过TGF-β/钙信号激活建立骨生成“助推器”，我们调节了微环境，实现了显著的骨缺损修复。这项研究为协同减弱异种移植免疫排斥提供了新的治疗前景，为克服异种骨移植中的免疫排斥挑战提供了一种创新的基因编辑骨修复策略。

引言
骨缺损已成为骨相关疾病中日益严重的挑战，常见于骨折、骨髓炎以及骨肿瘤切除后的术后重建。骨组织工程是一种有前景的骨缺损治疗策略，包括自体骨移植、同种异体移植和异种移植[1],[2]。过去十年中，用于缺损重建的骨移植策略显示出显著增长趋势，自体移植和同种异体移植占临床应用的76%[3],[4]。令人担忧的是，作为骨缺损最常见的原因，骨质疏松性骨折的发病率持续上升，预计到2024年将翻倍[5]。一项回顾性研究进一步显示，1990年至2020年间，骨质疏松性骨折的全球经济负担大幅增加，并且预计未来这一趋势将持续[6]。目前，美国和欧洲国家的骨缺损修复年度支出已超过30亿美元[7]。理想的骨修复材料应具有易于获取、机械稳定性和普遍适用性等优势[8]。自体骨移植长期以来一直是骨修复手术的金标准，因其低免疫原性和强的骨诱导活性；然而，其应用受到骨相关疾病、供体来源有限和移植体积受限等因素的限制[9]。此外，同种异体骨来源也受到伦理考虑和供应短缺的众多限制，无法可靠地满足不断增长的骨移植需求。鉴于这些情况，异种脱钙骨基质（DBM）作为一种生物来源的骨修复材料具有很大的潜力。猪和牛的骨骼在结构和成分上与人类骨骼相似。经过脱细胞化、脱脂和其他处理步骤后，这些基质保留了胶原纤维支架、骨形态发生蛋白（BMPs）和多种生长因子，从而促进成骨细胞的附着和骨生成[10],[11],[12],[13]。然而，异种骨修复材料面临着由种间抗原-抗体差异引起的免疫排斥反应这一严峻挑战。在异种移植过程中，主要组织相容性复合体（MHC）分子α-Gal、Neu5Gc和SDa抗原来自骨髓细胞、骨细胞和成骨细胞，以及残留的DNA，共同介导移植免疫排斥[14],[15],[16],[17],[18]。根据发病时间和潜在机制，移植免疫排斥反应主要分为超急性排斥（HAR）、延迟异种移植排斥（包括急性体液排斥和急性细胞排斥）和慢性排斥[19]。具体来说，在HAR中，受体血清中的抗α-Gal抗体与移植血管内皮上的α-Gal抗原表位结合，从而引发补体产生和激活，最终损害移植血管的完整性并导致组织坏死[20],[21]。同样，MHC、Neu5Gc和SDa抗原与急性体液异种移植排斥密切相关，通过与IgG和IgM结合触发补体激活级联反应，导致免疫沉积、血栓形成和组织坏死[22],[23],[24]。相比之下，急性细胞异种移植排斥涉及大量免疫细胞的浸润。巨噬细胞和树突状细胞负责抗原识别和呈递，从而激活移植微环境中的自然杀伤（NK）细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞，最终通过先天性和适应性免疫系统导致移植损伤[25],[26],[27],[28]。最后，持续的炎症反应是慢性免疫排斥的标志，其中CD4+T细胞在其进展中起关键作用[29],[30],[31]。这些研究表明，异种抗原和免疫细胞在移植免疫排斥中发挥关键作用，为解决这一挑战提供了明确的方向。

CRISPR-Cas9技术已成为系统解决异种移植挑战的革命性工具。自2012年问世以来，CRISPR-Cas9使研究人员能够以前所未有的精确度和效率对猪进行多重基因编辑，从根本上重建供体器官的免疫兼容性和生物安全性。具体而言，CRISPR-Cas9介导的糖基转移酶基因GGTA1、CMAH和B4GALNT2的敲除，这些基因负责合成猪特异性碳水化合物抗原，产生了“三重敲除”猪模型，从而消除了人类预先形成的抗体的主要靶标，阻断了超急性排斥反应[32]。然而，补体系统也参与移植排斥过程，并对异种移植的成功至关重要[33]。基因编辑的优势不仅限于基因敲除；它还允许插入人类保护基因，以进一步缓解与异种移植相关的并发症。为了增强猪器官抵抗人体内补体（C3b/c和C4b/c）激活和凝血失调的能力，研究人员将人类补体调节蛋白基因（CD46、CD55和CD59）和抗凝基因（血栓调节蛋白）引入猪基因组，从而赋予猪器官“人源化”的自我保护机制，显著减轻了抗体介导的排斥和血栓微血管病变[34]。通过精确的基因组“改造”，基因编辑技术系统地解决了异种移植中的免疫排斥和生物安全性问题，为后续的异种器官移植铺平了可行的技术途径。基于这些考虑，我们构建了一种三重基因敲除的猪来源移植，并采用Urist方法进行骨处理，以进一步抑制移植排斥并促进骨形成（3KODBM）。这种双重修饰策略的原理有三个方面：首先，抗原相关基因编辑和Urist方法的协同作用实现了更彻底的抗原和钙去除效率，从而实现了免疫排斥减弱和骨生成增强的有机整合。其次，3KODBM促进了骨修复微环境中巨噬细胞介导的炎症反应和骨生成功能的调节。第三，在植入后的早期阶段，M1型巨噬细胞释放炎症因子，介导炎症反应并招募间充质干细胞（MSCs），为骨修复奠定“基础”[35],[36]；在中后期阶段，BMP-2和BMP-7促使单核细胞向M2型巨噬细胞极化，后者再招募MSCs并释放TGF-β，与BMPs共同促进骨形成[37],[38],[39]。

在这项研究中，我们研究了GGTA1、CMAH和B4GALNT2抗原基因在异种移植免疫排斥中的作用。我们评估了异种抗原对骨修复微环境的影响。最重要的是，我们确认α-Gal、Neu5Gc和SDa抗原是异种骨移植成功的关键决定因素。此外，我们证明3KODBM通过减弱免疫排斥和对BMP诱导的骨生成具有“制动”效应，从而协同调节骨修复微环境，最终促进骨缺损修复。总之，我们强调敲除主要异种抗原基因与Urist方法处理的异种生物衍生物骨修复材料的联合应用，有效地重塑了骨移植的免疫微环境；3KODBM共同释放的BMPs协同促进了骨缺损修复。

材料
THP-1巨噬细胞诱导和分化试剂盒（CA5020）购自北京Solarbio科技有限公司。人补体成分3（C3）ELISA试剂盒（E-EL-H6054）、人补体成分4（C4）ELISA试剂盒（E-EL-H6309）、人免疫球蛋白G（IgG）ELISA试剂盒（E-EL-H0169）、人免疫球蛋白M（IgM）ELISA试剂盒（E-EL-H1814）、大鼠IgM ELISA试剂盒（E-EL-R3054）和大鼠IgM ELISA试剂盒（E-EL-R0518）购自武汉Elabscience生物技术有限公司。

3KODBM的制备
GGTA1、CMAH和B4GALNT2抗原基因在异种移植免疫排斥中起关键作用。通过基因编辑技术，成功获得了敲除GGTA1、CMAH和B4GALNT2的三重基因编辑巴马猪。RT-qPCR显示，编辑后的猪中这些基因的表达水平显著低于野生型猪，证实了三重抗原基因敲除的成功——与先前的研究结果一致（图S1a）[41]。

结论
本研究成功构建了一种经过三重基因编辑（GGTA1/CMAH/B4GALNT2）并通过Urist方法处理的异种脱钙骨基质（3KODBM）。通过“基因敲除-化学脱钙”的协同策略，系统地解决了异种骨移植中的免疫排斥和骨生成能力受损的双重挑战。研究表明，3KODBM通过以下机制实现了优异的骨修复效果：(1) 免疫排斥“制动”。