乙醇诱导的细胞亚稳态增敏用于铜基氧化肿瘤治疗

《Biomaterials》：Ethanol-Induced Cellular Metastable State Sensitization for Copper-Based Oxidative Tumor Therapy

　　

摘要

乙醇诱导的细胞内活性氧风暴为氧化肿瘤治疗提供了启示。尽管基于乙醇的治疗提供了经济性和低毒性等益处，其安全性和治疗效率仍面临挑战。在此，我们开发了一种聚乙二醇稳定的纳米级乙氧基铜（Nano-CuEOP），实现了安全高效的乙醇递送。被黑色素瘤细胞内吞后，Nano-CuEOP 释放乙醇并转化为纳米氧化铜聚集体（Nano-HCuEO）。乙醇诱导的“亚毒性”效应上调了细胞内细胞色素 P450 2E1 的表达，驱动细胞进入对过渡金属高度敏感的亚稳态。这反过来增强了 Nano-HCuEO 的催化活性和铜离子毒性。单次瘤内注射 Nano-CuEOP 实现了有效的黑色素瘤治疗并重塑了免疫微环境。与αPD-1 联合使用，该系统触发了强烈的全身抗肿瘤反应。本研究引入了一种乙醇诱导的亚稳态调节策略来增敏铜基肿瘤治疗，并推进了金属醇盐在癌症治疗中的应用。

引言

过度饮酒激活肝细胞中的乙醇（EtOH）代谢途径，导致活性氧（ROS）过度产生。这一过程反过来导致酒精性肝损伤（ALI），并可能导致肝炎、肝纤维化甚至肝癌 [1], [2], [3]。涉及上述疾病进展的关键酶之一是细胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)。EtOH 可以诱导细胞中 CYP2E1 的表达，并催化超氧阴离子（O₂^•–）和过氧化氢 H₂O₂的形成 [4], [5]。升高的 H₂O₂在细胞内过渡金属离子的催化下，产生高氧化性和毒性的羟基自由基（•OH），导致脂质过氧化（LPO）和氧化应激 [6], [7]。在正常情况下，细胞内过渡金属离子无毒。然而，当 EtOH 上调 CYP2E1 表达时，细胞进入亚稳态，这放大了过渡金属离子的毒性，导致不可逆的细胞损伤（图 1a）。尽管肝脏是 CYP2E1 表达的主要部位，但 CYP2E1 是一种内质网相关细胞色素 P450 酶，也可在肝外组织和细胞类型中检测到，包括黑色素瘤 [8]。因此，可以通过 EtOH 诱导黑色素瘤细胞中高表达 CYP2E1，对黑色素瘤细胞造成氧化损伤。值得注意的是，影像引导经皮乙醇注射治疗（PEIT）已应用于临床肿瘤治疗 [9], [10]。然而，PEIT 仍面临一些挑战。脂溶性 EtOH 的快速扩散降低了其治疗效果，通常需要重复注射才能取得明显的治疗效果 [11]。此外，高浓度 EtOH 的意外泄漏会给患者带来显著疼痛 [12]。因此，开发一种安全有效的 EtOH 递送载体以增强肿瘤治疗具有重要的临床意义。

肿瘤的氧化治疗是一类通过诱导细胞氧化应激来杀死肿瘤细胞的治疗策略 [13], [14]，涵盖化疗 [15]、放疗 [16]、光动力治疗 [17]、声动力治疗 [18] 或催化治疗 [19]。近年来，基于过渡金属氧化物纳米材料（TMONs）的催化治疗策略因其独特且高度特异性的抗肿瘤效果而得到广泛发展 [20], [21]。TMONs 产生的细胞毒性机制可以概括为以下两个方面：1) TMONs 的催化毒性：具有过氧化物酶样（POD）特性的 TMONs 可以催化肿瘤中升高的 H₂O₂分解为高毒性的•OH，提供了一种肿瘤特异性的治疗方法 [22], [23]。这种被称为纳米催化治疗的方法近年来已被广泛研究并应用于治疗各种疾病 [24]。2) 从 TMONs 解离出的金属离子的生物毒性。例如，铜过载诱导的细胞死亡，也称为铜死亡 [25]，受到了广泛关注。铜死亡是一种铜依赖性的调控细胞死亡形式。铁氧还蛋白 1 (FDX1) 通过 (巯基酰化合成酶) LIAS 途径促进蛋白质巯基酰化，使铜结合到巯基酰化二氢硫辛酰胺 S-乙酰转移酶 (DLAT) 上。这诱导了 DLAT 聚集、蛋白毒性应激、线粒体功能障碍，最终导致细胞死亡 [26], [27]。虽然 TMONs 表现出有希望的抗肿瘤效果，但其单药治疗疗效通常有限。因此，需要额外的辅助策略，例如与其他治疗或靶向机制的联合治疗，以增强其有效性。

金属醇盐是由醇衍生而来的有机化合物，通过用金属原子替换羟基（-OH）中的氢原子，通常遵循通式 M(OR)_n，其中 M 代表金属，OR 代表烷氧基 [28], [29]。金属醇盐通常用作制备金属氧化物的前驱体，特别是在溶胶 - 凝胶过程中（例如，用于二氧化钛的四乙氧基钛 (TTET) [30]），在陶瓷、玻璃和涂料的生产中有广泛应用 [31], [32]。金属醇盐在水存在下倾向于分解形成金属氧化物 [33]。通常，金属醇盐向金属氧化物的转化分为两步：1) 水解，其中金属醇盐与水反应，释放醇并转化为金属氢氧化物（式 1）；2) 缩合，其中金属氢氧化物发生缩合形成金属氧化物（式 2）。因此，与前面讨论的 TMONs 的单一功能相比，金属醇盐由于其 EtOH 储存/释放和转化为金属氧化物的双重能力而提供了独特的优势，显示出增强肿瘤治疗疗效的巨大潜力。水解：M(OR)_n + xH₂O → M(OH)_x(OR)_n-x + xROH缩合：-M-OH + H-O-M → -M-O-M- + H₂O 或M-OH +R-O-M → -M-O-M- + ROH在本研究中，我们合成了纳米级乙氧基铜（Nano-CuEO），并提出了一种 EtOH 诱导的细胞亚稳态调节策略，用于增敏铜死亡和纳米催化肿瘤治疗。最初，通过复分解法由 CuCl₂和乙氧基锂（LiOEt）制备块状乙氧基铜（Cu(OCH₂CH₃)₂, CuEO） [34]。随后，通过超声剥离获得纳米级 CuEO。最后，用磷脂 -PEG 修饰 Nano-CuEO 表面，以减缓 Nano-CuEO 的水解并增强其生物相容性，得到最终配方 Nano-CuEOP（图 1b）。被黑色素瘤细胞内吞后，Nano-CuEOP 经历水解 - 缩合过程，释放 EtOH 并同步转化为纳米氧化铜（CuO）聚集体。水解 - 缩合后的产物命名为 Nano-HCuEO。升高的细胞内 EtOH 水平有效提升了 CYP2E1 的表达，增加了 O₂^•–和 H₂O₂的水平。随后，连续产生的 H₂O₂在 Nano-HCuEO 的催化下，通过类 Fenton 反应产生高毒性和氧化性的•OH，诱导肿瘤细胞中的 LPO 和线粒体损伤。此外，从 Nano-HCuEO 释放的铜离子可以通过触发铜死亡来诱导细胞毒性（图 1c）。这种 EtOH 诱导的细胞亚稳态转变促进了铜基肿瘤治疗结果，有效触发了肿瘤免疫原性细胞死亡（ICD），并在体内激活了抗肿瘤免疫反应。与免疫检查点抑制剂αPD-1 联合使用时，这种 Nano-CuEOP 不仅能有效治疗原发性肿瘤，还能抑制远端肿瘤的生长。此外，Nano-CuEOP 还能有效抑制黑色素瘤肿瘤术后的复发和肺转移（图 1d）。这项工作采用了巧妙的材料设计，实现了高效的 EtOH 调节细胞亚稳态，以增强铜基肿瘤治疗疗效，并明显增强了抗肿瘤免疫反应。

章节片段

材料

化学品：氯化铜 (CuCl₂)、二烯丙基硫醚 (DAS)、乙醇 (EtOH)、正己烷、乙氧基锂溶液 (LiOEt, 乙醇中 1.0 M)、聚乙烯吡咯烷酮 -K30 (PVP-K30) 和四硫代钼酸盐 (TTM) 购自 Sigma-Aldrich PTE Ltd (新加坡)。5,5-二甲基 -1- 吡咯啉 -N- 氧化物 (DMPO) 和辛酸钠 (OANa) 购自 BLD Pharmatech Ltd。1,2-二硬脂酰 -sn- 甘油 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[氨基 (聚乙二醇)-2000] (DSPE-PEG_2K) 和 DSPE-PEG_2K-荧光素

Nano-CuEO 的合成与物理化学表征

Nano-CuEO 的制备示意图如图 2a 所示。首先，我们在室温下通过 LiOEt 和 CuCl₂在 EtOH 中的复分解法方便地制备了 CuEO 的深蓝色沉淀（图 S1）。随后，将制备好的 CuEO 沉淀离心、冻干，并在无水 EtOH 中重新分散，然后在冰水浴条件下进行剧烈超声剥离以获得 Nano-CuEO。如透射电子所示

结论

受 EtOH 诱导的细胞内氧化应激启发，我们开发了一种金属醇盐纳米平台，利用 EtOH 放大细胞内 ROS 用于黑色素瘤治疗。Nano-CuEO 通过超声剥离制备，并用磷脂 -PEG 包被，以减少 EtOH 过早泄漏并提高生物安全性。细胞摄取后，Nano-CuEOP 经历水解 - 缩合，释放 EtOH 并转化为纳米级氧化铜聚集体。细胞内 EtOH 上调了 CYP2E1 并

CRediT 作者贡献声明

Yang Liu: 写作 - 初稿，验证，方法论，调查，形式分析，数据整理。 Muchao Chen: 调查，形式分析。 Jinqiao Zhang: 调查，形式分析。 Yun Chen: 调查，形式分析。 Zhaoyu Ma: 调查，形式分析。 Ziliang Dong: 写作 - 审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取。 Wenbin Zhong: 调查，形式分析。 Yanli Zhao: 写作 - 审阅与编辑，监督，项目

竞争利益声明

作者声明没有利益冲突。

竞争利益声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些因素可能会影响本文中报告的工作。

致谢

我们要感谢 新加坡国家研究基金会在其竞争性研究计划 (NRF-CRP26-2021-0002) 下的财政支持，以及 国家自然科学基金（22307057 和 52302350）。我们要感谢 biorender.com 在示意图创建方面提供的帮助。

Yang Liu|Jinqiao Zhang|Muchao Chen|Zhaoyu Ma|Yun Chen|Wenbin Zhong|Ziliang Dong|Yanli Zhao

南洋理工大学化学、化学工程与生物工程学院，WRIN，新加坡 637371，新加坡南阳林 21 号