新型荧光标记物用于植入前胚胎连续活体成像的评估

《Journal of Developmental Biology》：Evaluation of a Novel Fluorescent Marker for Continuous Live Imaging of Preimplantation Embryos

　　

本研究评估了ChromaLIVETM（一种为多色、混合即读式活细胞成像开发的多色荧光标记物）在胚胎学背景下的表现。研究旨在评估该标记物是否与动态胚胎发育兼容至囊胚（blastocyst）阶段，对小鼠2细胞期胚胎在延时（time-lapse）成像条件下培养至囊胚阶段（无论有无ChromaLIVETM）的胚胎活力、完整性或正常生长影响最小。结果显示，ChromaLIVETM组与对照组囊胚形成率相当，高质量囊胚比例也相似。尽管在两个动力学事件（t3和tSB）中观察到轻微但统计学显著的延迟，其他发育时机未受影响。延时共聚焦荧光成像表明，ChromaLIVETM染料在整个发育过程中提供了稳定、明亮、高分辨率的3D可视化效果，可显示细胞膜、细胞质以及滋养外胚层（trophectoderm）、内细胞团（inner cell mass）和囊胚腔（blastocoel）等胚胎结构。最后，转录组分析揭示染色与未染色胚胎间存在有限数量的基因表达差异；虽涉及发育和代谢通路，胚胎仍以与对照组相当的方式发育至囊胚阶段。

研究背景与动机

在胚胎学研究中，计算机视觉与人工智能（AI）驱动分析方法的整合日益加深，对活细胞成像标记物的需求不断上升。理想标记物应能在不干扰培养条件、不损害活力与正常发育的前提下，对从2细胞期至囊胚期的细胞运动与分裂进行时序追踪，且具备生物惰性、无毒、信号稳定、光毒性低等特征。然而现有商用标记物多存在细胞毒性、需复杂染色步骤或无法同时可视化多细胞结构等局限，制约了常规研究中的长期活成像应用。鉴于胚胎系统对荧光探针的响应可能不同于常规细胞或类器官模型，研究人员开展本研究以评估ChromaLIVE^TM（一种基于分子转子机制、非靶向特异性、多色、混合即读式活细胞染料，可被动整合细胞膜结构而无需固定或洗涤）在植入前胚胎延时培养中的兼容性、安全性与成像效能。

样本与技术方法概述

研究人员采用冻存F1杂交（B6C3F1×B6D2F1）小鼠2细胞期胚胎（购自Embryotech Laboratories Inc.）为样本队列，在SAGE 1-Step培养基中培养至囊胚，实验组加入1:1000 ChromaLIVE^TM（n=49），对照组仅培养基（n=47），于MIRI TL延时培养箱（37°C、5% CO₂、5% O₂）中监测。关键技术包括：基于ESHRE指南与Gardner分类的形态动力学（morphokinetic）标注与囊胚质量评估；Yokogawa CellVoyager CQ1自旋盘共聚焦显微镜对19枚活胚胎每6小时采集z栈（5 μm步长、17层）的多通道荧光成像；转录组学上设ChromaLIVE^TM、0.1% DMSO溶剂对照与无添加对照三组（各n=3囊胚），用SMART-Seq mRNA建库、Illumina NextSeq 2000测序，Salmon定量，DESeq2做差异表达分析（FDR<0.05且|log₂FC|>1）；统计用卡方检验与Welch t检验。

研究结果

3.1 囊胚评估与胚胎发育动力学

研究人员比较两组囊胚率（ChromaLIVE^TM 73.4% vs 对照82.9%）与优质囊胚率（48.6% vs 47.4%），无显著差异。ChromaLIVE^TM组在t3（8.7 h vs 6.8 h）与tSB（59.3 h vs 51.1 h）两个节点显著延迟，但s2、s3、cc3a、cc3b、cc3、ECC3等细胞周期参数与tM、tSC、tEC等其他时机无差异，表明整体动力学框架保留，延迟为局部瞬时现象。

3.2 共聚焦活体成像

对19枚胚胎96小时培养期成像显示，ChromaLIVE^TM在2细胞至8细胞期清晰分辨卵裂球膜、质与核；囊胚期可区分滋养外胚层、内细胞团与囊胚腔。三通道（488 nm激发~600 nm与~700 nm发射、561 nm激发~600 nm发射）提供稳定明亮信号，支持全期3D最大强度投影动态记录。

3.3 转录分析

3.3.1 测序与映射：三条件文库均获>9百万读数，约90%映射至参考转录组，得77,179基因矩阵。

3.3.2 PCA：PC1（30.0%）与PC2（15.8%）均未将ChromaLIVE^TM、DMSO与对照分开，各组重叠；对照复制间PC2离散度反而更大，说明染料未引起全局转录重排。

3.3.3 差异表达：仅556基因（0.72%）达标，285上、271下；含Itgb3、Slc2a1、Sema4c、Sbsn、Prlr（上调）及Txnip、Mrs2、Npr3（下调），涉及黏附、葡萄糖转运、发育信号、氧化还原等，但不聚集于凋亡/应激单一通路。GO富集指向发育生长、缺氧、血管与代谢，非毒性特征。

讨论部分总结

研究人员指出，囊胚率与质量可比、多数动力学不受影响，证明长期染色不损发育能力；t3/tSB延迟可能为染料或含0.1% DMSO载体引发的瞬时代谢/ redox适应，因早期延迟在囊胚期前消解且DMSO单独转录影响极小。转录扰动<1%且无聚类，支持“非毒性”结论。成像上，分子转子机制使染料随微环境黏度/极性变信号，可同步多结构可视化，优于单靶标染料与无标记相衬。局限含形态动力学未设DMSO匹配组、转录n=3统计力低、20×分辨率限、F1杂交株系耐受性或不代表近交系。意义在于为AI胚胎评估提供高内涵时序数据，但植入后发育需移植实验验证。

结论翻译

本研究凸显了使用ChromaLIVE^TM作为荧光标记物连续追踪胚胎而不损伤其发育或囊胚质量的可行性。尽管观察到早期卵裂动力学的轻微差异，RNA-seq分析证实这些变异反映了良性分子与细胞适应，确认了该标记物在表型与分子水平的安全性。这些发现验证了该标记物作为高分辨率胚胎成像稳健工具的价值，在生殖研究与AI驱动胚胎评估中具有潜在应用。