在患有红变综合征的七鳃鳗病毒组中发现的分歧冠状病毒

《Journal of Virology》：Divergent coronaviruses discovered in the virome of lamprey with reddening syndrome

　　

七鳃鳗红变综合征（LRS）是一种影响袋七鳃鳗（Geotria australis；毛利语kanakana/piharau）的新兴疾病，该物种在新西兰（Aotearoa）具有文化和生态意义。该病以皮肤出血和死亡率升高为特征，但尽管经过既往多次调查，其病因仍未明确。研究人员采用宏转录组学方法，对新西兰和澳大利亚塔斯马尼亚州的28只七鳃鳗（包括患病个体和推测健康个体）的病毒群落进行了表征。该分析揭示了8种感染鱼类的RNA病毒，其中7种为新病毒，包括两种高度分化的冠状病毒。其中一种冠状病毒具有双节段基因组结构，并且有3只七鳃鳗同时感染了这两种冠状病毒。虽然这些冠状病毒在健康个体和患病个体中均被检测到，但出现红变的七鳃鳗表现出显著更高的病毒丰度，这是由两种病毒的RNA转录本升高所致。这一模式提示，患病个体中冠状病毒复制的增加可能受到宿主对环境因素的应激或与其他病原体共感染的影响，而非作为疾病的唯一病因。除确定候选病毒关联外，本研究还扩展了一个古老脊椎动物谱系的已知病毒圈，并展示了基于基因组学的诊断方法用于调查受威胁野生动物疾病的应用价值。

袋七鳃鳗（Geotria australis，毛利语kanakana/piharau）是新西兰（Aotearoa）一种具有深远进化起源的溯河洄游鱼类，在文化和生态上具有重要意义。近年来，该物种中出现一种被称为七鳃鳗红变综合征（lamprey reddening syndrome，LRS）的新兴疾病，以皮肤出血、组织发红和死亡率升高为特征。自2011年在新西兰首次确认以来，虽有多种细菌被分离，但始终未找到一致病原体；类似临床表现也在澳大利亚西部出现，提示种群间存在共享易感性或传播。传统诊断方法依赖已知病原体的培养或靶向PCR，难以应对新发或难以培养的病原体，而对受威胁物种进行破坏性取样又受限。因此，本研究旨在利用宏转录组学（metatranscriptomics）这一不依赖先验知识的测序方法，系统刻画新西兰和塔斯马尼亚袋七鳃鳗的病毒组（virome），比较患病与健康个体的病毒组成与丰度，评估红变是否与病毒感染一致。研究人员对28只七鳃鳗进行了总RNA测序，鉴定出8种感染鱼类的RNA病毒，其中7种为新病毒，并发现两种高度分化的冠状病毒。尽管病毒丰度在红变个体中显著升高，但数据显示LRS更可能是多种微生物共同作用的结果，而非单一病毒所致。该研究扩展了古老脊椎动物谱系的病毒多样性知识，并展示了基因组学辅助诊断在濒危野生动物疾病调查中的应用，成果发表于《Journal of Virology》。

在方法上，研究人员于新西兰南岛Mataura河（17只）和澳大利亚塔斯马尼亚州德文特河（11只）采集袋七鳃鳗，按表观健康状态分为红变、轻微发红、健康和未知疾病组；每只个体取皮肤、鳃、肾、肝和肌肉组织提取总RNA，等体积合并为单一文库，共构建28个文库。文库使用Illumina链特异性总RNA制备及Ribo-Zero Plus试剂盒构建，在NovaSeqX平台进行150 bp双端测序。生物信息流程包括Trimmomatic修剪、MEGAHIT组装、DIAMOND BLASTx与NCBI非冗余蛋白库比对以鉴定病毒；使用Bowtie2将读段映射至病毒基因组并计算每百万读段数（reads per million，RPM）作为丰度指标；病毒系统发育基于保守的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）区域，以MAFFT比对和IQ-TREE构建最大似然树；统计比较使用Kruskal-Wallis检验和置换多元方差分析（PERMANOVA）。

一、七鳃鳗红变综合征的分类（Classification of lamprey reddening syndrome）
通过外部表型评估，新西兰样本中10只表现为红变，5只仅轻微发红但其他方面健康，2只无皮肤疾病证据；塔斯马尼亚样本中9只推测健康，2只有潜在相关的外部异常（如鳃孔出血、真菌样病灶）。每只个体活检3–5个组织，RNA合并后测序，平均每文库获得约1.01亿条读段。

二、病毒多样性与丰度（Diversity and abundance of kanakana viruses）
宏转录组分析共检出8种感染鱼类的RNA病毒，其中7种为新种（保守RdRp氨基酸相似性<90%），另发现一种可能的无脊椎动物病毒。在病毒科水平，冠状病毒科（Coronaviridae）相对丰度最高，星状病毒科（Astroviridae）次之，正黏液病毒科（Orthomyxoviridae）和小RNA病毒科（Picornaviridae）仅在个别文库中出现。红变个体的标准化总病毒丰度显著高于健康个体（Kruskal-Wallis检验，χ²=9.75，P=0.021；Dunn事后检验BH校正P=0.025）。α多样性（Shannon指数及病毒科丰富度）在健康状态间无显著差异；β多样性（Bray-Curtis距离）受健康状态和采样地点显著影响（PERMANOVA P=0.003），红变个体与健康个体间差异显著（P=0.003），说明红变个体驱动了群落组成差异。

三、病毒系统发育分析（Phylogenetic analysis of kanakana viruses）
基于RdRp的最大似然系统发育树显示，星状病毒科中4个新病毒被命名为Geotria australis piscistrovirus 1–4，与已知鱼类星状病毒关系密切，但氨基酸相似性较低（约29%–46%）。正黏液病毒科中发现Geotria australis influenza-like virus，与鲟鱼流感样病毒相似性36%；小RNA病毒科中发现Geotria australis picornavirus，与水生脊椎动物病毒聚类。这两种病毒均出现在健康或轻微异常个体中且丰度低，提示不致病。冠状病毒科中，Geotria australis coronavirus和Kanakana letovirus均与感染鱼类的病毒形成姐妹支，且高度分化；前者BLASTp最佳匹配为鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV），但仅34%的氨基酸相似性，且其基因组大小约35594 nt，大于常见脊椎动物冠状病毒的26–32 kb；后者则与Pitovirinae亚科的已知双节段病毒聚类，并通过配对末端读段及先导-体连接reads证实了双节段基因组。

四、对冠状病毒的探究（Exploration of the coronaviruses）
读段mapping丰度分析显示，Kanakana letovirus在红变个体中的丰度显著高于健康个体（BH校正P=0.038）和轻微发红个体（P=0.048），而Geotria australis coronavirus丰度在不同健康状态间无显著差异（P=0.076）。将红变和轻微发红组合并后，两种冠状病毒总丰度与疾病呈边缘关联（P=0.05006），提示冠状病毒感染可能参与但并非唯一病因。地点比较显示两个病毒在Mataura的丰度均显著高于塔斯马尼亚（P=0.005和P=0.006）。此外，3只七鳃鳗（2只红变、1只健康）同时感染两种冠状病毒。对Kanakana letovirus的基因组结构分析发现，其复制酶ORF1ab位于节段1，结构蛋白和辅助蛋白位于节段2，且存在典型的冠状病毒亚基因组RNA先导-体连接点，表明两节段共转录。

五、潜在寄生病毒（Potential parasitic viruses）
一种属于单股反链病毒目（Mononegavirales）的新病毒（暂名Geotria australis-associated mononega-like virus）被组装出全长14902 nt基因组，其最佳匹配为一种来自昆虫的病毒（氨基酸相似性28.72%），因此可能来源于寄生虫、食物或环境污染物，并非感染七鳃鳗。

讨论部分，研究人员指出，这是迄今对LRS病毒组最全面的刻画。红变个体总病毒丰度升高，且Kanakana letovirus丰度与疾病显著关联，而Geotria australis coronavirus无显著关联，说明病毒复制增加可能由宿主应激或机会性细菌和卵菌（oomycete）共感染驱动，LRS应被视为多种微生物共同作用的综合征。两种冠状病毒的系统发育和基因组结构差异表明，它们可能通过两次独立的跨宿主事件从其他鱼类进入七鳃鳗，而非与宿主共同进化。地理上，新西兰和塔斯马尼亚病毒组组成显著不同，但多种病毒共有，且疾病差异主要来自丰度而非有无，因此地理隔离难以解释LRS在新西兰的显现。研究同时承认，宏转录组学检测不能确立致病性，且新西兰健康个体数量有限，未来需更大样本和纵向取样。

研究结论部分可总结为：总之，这些结果表明，LRS最好被理解为一种多微生物综合征，其中冠状病毒感染（即Kanakana letovirus）可能与宿主的应激状态或机会性细菌和卵菌感染共同作用。虽然因果关系仍有待最终证实，但基于基因组学的方法解决了围绕LRS的长期不确定性，并为未来研究提供了明确的病毒候选。更广泛地说，本研究扩展了感染古老脊椎动物的病毒多样性和基因组结构，并展示了宏转录组学在阐明受威胁野生动物复杂疾病过程中的作用。