快速ESBL-Carba Combo PN试验用于同时检测肠杆菌目细菌中的ESBL和碳青霉烯酶活性

《Microbiology Spectrum》：Rapid ESBL-Carba Combo PN test for simultaneous detection of ESBL and carbapenemase activity in Enterobacterales

　　

摘要：研究人员开发了一种显色生化检测方法（ESBL-Carba Combo PN试验），用于同时检测肠杆菌目细菌中的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶活性，并用于区分临床相关的碳青霉烯酶类别。该检测方法基于一种新型显色底物B-Lac和低成本的Tris裂解缓冲液，为ESBL和碳青霉烯酶的检测提供了统一的工作流程。研究人员使用已通过全基因组测序预先确定耐药机制的、特征明确的临床分离株培养物对该检测方法进行了评估。每个分离株的平均制备时间约为3分钟，并在孵育20分钟和1小时后读取结果。在ESBL检测中（n=67），孵育20分钟和1小时后的敏感性分别为93.8%和97.8%，特异性为100%。碳青霉烯酶活性检测（n=92）在两个时间点的敏感性和特异性均为100%。使用联合检测方法（n=85）时，ESBL和/或碳青霉烯酶活性的检出敏感性和特异性均为100%。对于Ambler A类和B类酶，孵育20分钟后即达到100%的敏感性和特异性。对于D类碳青霉烯酶，孵育20分钟和1小时后的敏感性分别为91.3%和95.5%，两个时间点的特异性均为100%。ESBL-Carba Combo PN试验提供了一种简单、低成本（<1美元/样本）、快速（约3分钟制备时间，1小时内读取结果）的解决方案，用于检测这些耐药机制。其统一的工作流程和对碳青霉烯酶类别的鉴别能力使其特别适用于资源有限的环境。
重要性：快速鉴定产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌（CPE）对于优化抗菌治疗和及时实施感染控制措施至关重要。目前大多数可用的快速表型检测方法分别检测这些耐药机制，增加了操作时间、工作量、试剂消耗和成本，尤其是在共产生多种β-内酰胺酶的分离株中。此外，碳青霉烯酶类别之间的区分，特别是A类和D类碳青霉烯酶，对大多数生化检测方法而言仍具挑战性。本研究描述了一种简单的显色检测方法，可使用单一底物和低成本裂解缓冲液同时功能性检测两种酶类型。通过引入瑞来巴坦（relebactam）作为选择性A类抑制剂，该检测方法提高了A类和D类碳青霉烯酶之间的表型区分能力，同时保持了可靠的ESBL检测。快速的ESBL-Carba Combo PN试验可在1小时内提供最具临床相关性的β-内酰胺耐药机制的表型信息，是指导早期抗生素治疗的有用工具。

**论文解读：快速ESBL-Carba Combo PN试验——肠杆菌目细菌ESBL与碳青霉烯酶同步检测的创新方法**

**一、研究背景与目的**

β-内酰胺类抗生素耐药已成为全球公共卫生的重大威胁，其中产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）和碳青霉烯酶的肠杆菌目细菌（CPE）感染与患者死亡率显著升高密切相关。大量研究证实，严重感染患者中有效抗菌治疗启动的延迟与死亡率呈直接正比关系。因此，早期、准确地识别耐药机制是脓毒症管理的基础，与改善患者生存率密切相关。

然而，目前可用的表型检测方法通常分别针对ESBL或碳青霉烯酶进行检测，这限制了对共产生两类酶的分离株的诊断效率。分子检测方法虽能灵敏地检出耐药基因，但无法直接评估这些基因是否在检测条件下表达或具有功能性活性，且无法覆盖所有类型的ESBL或碳青霉烯酶靶标。相比之下，表型检测方法可直接读取酶活性，但在检测低水平或弱表达的耐药机制方面可能受限。

当前肠杆菌目细菌共产生ESBL和碳青霉烯酶的高流行率使表型检测策略更加复杂，凸显了对能够在单一工作流程中识别两种耐药机制的整合检测方法的需求。此外，对于D类碳青霉烯酶（如OXA-48样酶）的准确识别仍是大多数生化检测方法的公认局限性，这归因于OXA-48样酶对法硼巴坦（vaborbactam）的弱且可变的水解活性以及其非典型的抑制模式。基于上述问题，研究人员开发了一种基于新型β-内酰胺显色底物（B-Lac）的显色生化检测方法，旨在统一工作流程中实现肠杆菌目细菌ESBL和碳青霉烯酶活性的联合检测。

**二、主要技术方法**

研究人员从法国和瑞士参考菌株库中选取了160株不同来源（包括痰液、尿液、血培养和皮肤）且具有明确β-内酰胺耐药机制的临床肠杆菌目细菌分离株，以全基因组测序作为耐药机制鉴定的参考标准，检测操作者在基因型结果盲态下进行试验评估。该检测采用新型显色底物B-Lac和自制的低成本Tris-HCl/Triton X-100/ZnSO?裂解缓冲液。ESBL检测部分使用头孢噻肟（CTX）作为底物、他唑巴坦（TAZ）作为抑制剂；碳青霉烯酶检测部分使用厄他培南（ETP）作为底物，并联合使用吡啶二羧酸（DPA，B类金属酶抑制剂）、阿维巴坦（AVI，A类和部分D类抑制剂）和瑞来巴坦（REL，A类选择性抑制剂）进行酶类别鉴别。联合检测（Combo PN试验）共使用7个反应管（A-G），在20分钟和1小时两个时间点读取结果，以Clopper-Pearson方法计算95%置信区间并评估敏感性和特异性。

**三、研究结果**

**1. 快速ESBL检测**

采用67株产生多种ESBL的肠杆菌目分离株对ESBL检测方法进行评估。重要的是，该检测方法能在共产生碳青霉烯酶（包括KPC、NDM和OXA-48样酶）的分离株中检出ESBL活性。孵育20分钟后，45株产ESBL分离株中有42株被正确识别，敏感性为93.8%（95% CI: 81.8%–98.4%），特异性为100%（95% CI: 84.6%–100%），无假阳性结果，有3个假阴性结果。孵育1小时后，假阴性结果降至1个，敏感性提高至97.8%（95% CI: 88.5%–99.9%），特异性保持100%。

**2. 快速碳青霉烯酶检测**

采用92株产生Ambler A类（KPC）、B类（NDM、VIM、IMP）和D类（OXA-48样）碳青霉烯酶的分离株及非产酶对照株进行评估。在20分钟和1小时两个时间点，所有产碳青霉烯酶分离株均被检出，敏感性和特异性均为100%（95% CI: 95.2%–100%和80.5%–100%）。基于抑制剂谱的碳青霉烯酶类别鉴定中，使用阿维巴坦和DPA可正确识别所有A类和B类酶。对于D类酶，20分钟时有2个分离株被错误分类，1小时时减少至1个。

**3. 快速ESBL-Carba Combo PN联合检测**

使用85株表达多种耐药机制（包括共产生ESBL和碳青霉烯酶的分离株）对联合检测方法进行评估。在两个时间点，联合检测的敏感性和特异性均为100%（95% CI: 95.4%–100%和59.0%–100%）。碳青霉烯酶类别区分方面，联合检测在两个时间点均正确识别所有A类和B类碳青霉烯酶。对于D类碳青霉烯酶，20分钟时检出2个假阴性，敏感性为91.3%（95% CI: 73.2%–98.7%），1小时后仅1个分离株仍被错误分类，敏感性提高至95.5%（95% CI: 78.2%–99.8%），特异性均为100%。7株产OXA-48样酶并共产生ESBL的分离株因缺乏他唑巴坦抑制而出现不确定结果，未纳入性能指标计算。

**四、讨论与结论**

该联合检测方法（Combo PN试验）代表了现有快速生化检测方法的显著改进。传统的ESBL-NP和Carba-NP试验依赖商业裂解缓冲液（如B-PER，约840美元/250mL）和成本高昂且化学性质不稳定的头孢硝噻吩底物（约1.5美元/100mL，需每日新鲜配制），而本检测使用的Tris-HCl缓冲液成本极低，B-Lac底物价格约100美元/250mL且在4°C下可稳定保存长达9个月。相比仅限碳青霉烯酶检测且需长达3.5小时孵育的ResaCPE试验，Combo PN试验可在20分钟内提供可靠的多种耐药机制功能信息。

碳青霉烯酶类别的精确区分具有重要的治疗指导意义。A类酶（如KPC）通常可被阿维巴坦、法硼巴坦和瑞来巴坦抑制，使头孢他啶-阿维巴坦、美罗培南-法硼巴坦或亚胺培南-瑞来巴坦成为有效选择。B类金属酶不被上述抑制剂抑制，但对氨曲南敏感，常需与阿维巴坦联用以克服共产生的ESBL或AmpC酶的水解作用。1小时内的功能分类可支持早期选择含氨曲南-阿维巴坦的治疗方案。D类OXA-48样酶对头孢他啶-阿维巴坦可能敏感，本研究通过加入瑞来巴坦作为差异化抑制剂策略，显著提高了D类碳青霉烯酶的鉴别性能，尽管未达100%敏感性，但对OXA-48样产酶株的识别率较高。部分OXA-204和OXA-244产酶株出现假阴性可能与弱碳青霉烯酶活性和/或基因表达导致的瑞来巴坦部分抑制有关。不确定结果（7株中5株）可能与染色体AmpC过度产生干扰他唑巴坦活性有关，经含氯唑西林平板补充药敏试验证实了AmpC超表型。

研究的主要局限性包括：（i）某些碳青霉烯酶亚型数量有限，无法进行抑制剂策略间稳健的统计学比较；（ii）未进行多种微生物混合检测；（iii）产AmpC菌株可能掩盖ESBL活性或产生模糊的表型谱，需谨慎解读并可能需补充诊断方法。

**结论**：该检测方法在单一工作流程中对肠杆菌目细菌中两种最具临床相关性的β-内酰胺耐药机制提供快速功能检测。ESBL-Carba Combo PN试验以其简便性、低成本和试剂稳定性，向更可及、可扩展的肠杆菌目主要β-内酰胺耐药机制表型筛查迈出了一步。通过将ESBL和碳青霉烯酶检测与快速碳青霉烯酶类别区分相结合，该检测提供了准确的功能信息，有助于更早优化抗菌治疗并支持抗菌药物管理举措。