《Food Innovation and Advances》：Efficacy and mechanistic insights of Kluyveromyces marxianus cell wall in enhancing pear fruit resistance against Penicillium expansum
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采后真菌侵染对新鲜水果构成严重威胁，导致重大经济损失。本研究考察了酵母细胞壁诱导果实抗性的功效与机制，重点关注马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）提取物。与常用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞壁相
采后真菌侵染对新鲜水果构成严重威胁，导致重大经济损失。本研究考察了酵母细胞壁诱导果实抗性的功效与机制，重点关注马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）提取物。与常用的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞壁相比，施用马克斯克鲁维酵母细胞壁对梨果实抵抗扩展青霉（Penicillium expansum）侵染提供了更优越的保护，显著降低了病害发生率。该增强的生防活性归因于其独特的多糖组成——含60.37%甘露聚糖、38.34%葡聚糖和1.29%几丁质——及其特有的结构特性。该处理触发了快速的伤口氧化爆发，上调了关键抗氧化酶和防御相关酶，并促进了梨组织中γ-氨基丁酸的积累。转录组学分析揭示，β-葡聚糖和甘露聚糖组分协同激活了植物激素信号转导和植物-病原互作通路。值得注意的是，甘露聚糖特异性调控了碳水化合物代谢和MAPK相关的防御反应。这些发现确立了马克斯克鲁维酵母细胞壁作为一种强效且新颖的生防制剂，为通过靶向诱导果实先天免疫来管理采后腐烂提供了可持续策略。
论文解读：马克斯克鲁维酵母细胞壁诱导梨果实抗扩展青霉侵染的功效与机制研究
一、研究背景与目的
蓝霉病是梨果实采后贮藏期间最常见的病害，由扩展青霉（Penicillium expansum）引起。该病害严重影响鲜食梨果实的食用安全性、营养价值和商业价值，每年造成重大经济损失。传统防控依赖化学杀菌剂，但耐药菌株的出现以及化学杀菌剂对人体健康和环境造成的不可逆危害，限制了其进一步应用。近十年来，拮抗酵母用于生物防治已成为一种成熟且有前景的策略。然而，拮抗酵母的活力容易受到采后条件下pH、温度和氧化胁迫等非生物逆境因素的影响，导致其生防效果不稳定，甚至出现效力下降。因此，利用稳定的抗性诱导激发子有效激活寄主防御反应，已成为备受关注的研究方向。在此背景下，酵母细胞壁组分因其结构稳定性、安全性以及激活果实防御机制的强大潜力，被视为活体细胞的有前景的替代方案。
酵母细胞壁占细胞干重的15%-30%，是酵母最外层的动态细胞器，由甘露糖蛋白、β-葡聚糖、几丁质和蛋白质通过聚糖和糖脂锚定连接而成。酵母细胞壁除了维持细胞通透性和形态外，还通过大量受体与环境相互作用。本研究前期观察发现，灭活的马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）在梨果实中激发抗扩展青霉的抗性能力强于灭活酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但其潜在机制尚不明确。作为一种公认的食品级微生物，马克斯克鲁维酵母细胞壁组分作为果实抗病性诱导剂的研究仍十分有限。本研究旨在系统探究马克斯克鲁维酵母细胞壁诱导梨果实产生抗性的生理与分子机制，为其作为新型食品级激发子在采后水果保护中的应用奠定机制基础。
二、主要技术方法
研究人员从中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）获得马克斯克鲁维酵母（CGMCC 2.1442）、酿酒酵母、罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）和胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。供试梨果实为水晶梨（Pyrus pyrifolia Nakai. cv. 'Shuijing'），采购自中国河北邯郸，果实经0.1%（v/v）NaClO表面消毒后使用。扩展青霉（CGMCC 3.7898）在PDA培养基上25°C培养7天用于制备孢子悬浮液。研究中使用了高压液相色谱（HPLC）分析细胞壁单糖组成，傅里叶变换红外光谱（FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）表征细胞壁结构，荧光显微技术检测活性氧（ROS）积累，分光光度法测定酶活性，以及转录组测序分析差异表达基因。通过碱提法从酵母细胞壁中分别提取β-葡聚糖和甘露聚糖，并分别处理梨果实后进行转录组学分析。
三、主要研究结果
（一）灭活酵母对诱导梨果实抗扩展青霉的作用
研究人员用不同灭活酵母预处理梨果实24小时后接种扩展青霉，发现所有灭活酵母处理均显著增强了果实对蓝霉病的抗性，但效果差异明显。灭活马克斯克鲁维酵母、罗伦隐球酵母和胶红酵母的防效显著优于酿酒酵母，表现为更低的发病率和更小的病斑直径。将灭活酵母与病原菌同时接种或提前24小时接种进行比较，预处理组的抑制作用显著更强，表明灭活酵母主要通过激发果实先天防御反应发挥作用。扫描电镜观察显示，各灭活酵母菌株在形态上存在差异，酿酒酵母、罗伦隐球酵母和胶红酵母呈椭球形，而马克斯克鲁维酵母呈更加延长的形态，这种结构差异可能通过与果实表面受体的差异化互作而影响抗性诱导效果。
（二）酵母细胞壁对诱导梨果实抗扩展青霉的作用
研究人员分别用0.5%（w/v）的马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母细胞壁悬浮液处理梨果实24小时，发现马克斯克鲁维酵母细胞壁处理组的病斑直径和发病率均低于其他组。浓度梯度实验表明0.5%（w/v）为最佳抑制浓度。处理时间实验显示，处理时间从2小时延长至24小时，病斑宽度和发病率逐渐降低，而处理36小时则有所回升，抗性在24小时达到峰值，表明诱导抗性具有瞬时性特征。酵母细胞壁可能通过激发植物系统性防御信号（如系统获得性抗性，SAR）使梨果实产生系统性防御"记忆"。
（三）马克斯克鲁维酵母与酿酒酵母细胞壁的特性表征
HPLC分析结果显示，酿酒酵母细胞壁多糖含53.45%甘露聚糖、43.99%葡聚糖和2.56%几丁质，而马克斯克鲁维酵母细胞壁含60.37%甘露聚糖、38.34%葡聚糖和1.29%几丁质。虽然马克斯克鲁维酵母细胞壁的几丁质和葡聚糖含量略低于酿酒酵母，但其对蓝霉病的抑制效果却更强。按马克斯克鲁维酵母细胞壁多糖比例配制的商业多糖混合物虽也有抑制效果，但显著弱于完整细胞壁，说明细胞壁的结构和形态同样发挥重要作用。FTIR光谱显示两种细胞壁具有典型的β-糖苷键和多糖特征吸收峰。SEM观察发现，马克斯克鲁维酵母细胞壁具有更丰富、更复杂的孔隙结构和大量层状褶皱，而酿酒酵母细胞壁表面较为光滑。多孔粗糙的细胞壁表面可增加与果实的接触面积，使外层细胞壁有更多受体刺激果实，从而更有效地激发抗性。
（四）梨果实中ROS水平、抗氧化酶和防御相关酶活性
DCFH-DA荧光染色显示，孢子+0.5%细胞壁组的梨组织绿色荧光强度最高，表明马克斯克鲁维酵母细胞壁处理触发了显著的氧化爆发，ROS水平明显高于单独孢子组。ROS作为植物体内的信号分子可激活寄主免疫系统。在抗氧化酶方面，孢子+细胞壁组的SOD活性在24小时升高后下降，POD活性在12小时达到峰值并显著高于其他组，GR和CAT活性在整个过程中基本维持较高水平并在24小时达峰。在防御相关酶方面，几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和PAL活性先升后降并在24小时达峰，PPO活性在孢子+细胞壁组持续上升。这些病程相关蛋白（PR蛋白）可降解真菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质，PPO可将酚类化合物氧化为毒性更强的醌类物质，PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶，参与木质素和植保素等抗性物质的合成。结果表明，提高抗氧化酶和防御相关酶活性是马克斯克鲁维酵母细胞壁诱导梨果实抗性的重要机制之一。
（五）马克斯克鲁维酵母细胞壁对梨果实GABA支路的影响
在孢子+0.5%细胞壁组中，谷氨酸脱羧酶（GAD）活性持续升高并在36小时达到最高水平，GAD1基因相对表达量在处理组中显著升高。与对照组相比，仅细胞壁处理组梨果实内源GABA含量显著增加，同时GABA-T含量降低表明GABA分解代谢减弱。在GABA支路中，谷氨酸被GAD不可逆脱羧生成GABA，GABA经GABA-T转化为琥珀酸半醛（SSA），再由SSADH氧化为琥珀酸进入三羧酸（TCA）循环。马克斯克鲁维酵母细胞壁通过增加谷氨酸含量、提高GAD活性以及下调GABA分解代谢基因，促进梨果实内源GABA积累，这可能是诱导抗性反应中一个重要的代谢组分。
（六）细胞壁来源β-葡聚糖诱导梨果实抗性的转录组学分析
将酵母细胞壁中提取的β-葡聚糖处理梨果实后进行转录组分析。主成分分析（PCA）显示葡聚糖处理组与对照组明显分离。以Fold Change ≥ 2和FDR < 0.01为阈值，共鉴定出460个差异表达基因（DEGs），其中209个上调、251个下调。KEGG通路富集分析显示，植物激素信号转导和植物-病原互作通路显著富集。在植物激素信号通路中，油菜素甾醇（BR）通路受体基因BRI1、共受体基因BAK1和信号激酶基因BSK5均显著上调，茉莉酸（JA）通路中JA-Ile合成酶基因JAR1上调，但水杨酸（SA）信号通路无差异表达基因富集，表明β-葡聚糖主要通过激活BR和JA信号通路而非SA通路来增强梨果实抗性。在植物-病原互作通路中，Ca2+通道基因CNGC1被诱导，钙传感器CML46、CML41和CML45强烈上调，表明Ca2+依赖性信号被激活。Ca2+信号进一步通过MAPK级联转导，上调转录因子WRKY22和转录调控因子PTI5，促进PR蛋白积累。此外，抗性相关基因RPM1、RPS2和EDS1也显著上调，表明免疫信号和超敏反应（HR）得到强化。
（七）细胞壁来源甘露聚糖诱导梨果实抗性的转录组学分析
甘露聚糖处理梨果实的转录组分析显示，PCA中第一主成分（PC1）解释了38.48%的总方差，甘露聚糖处理组与对照组区分明显。共鉴定出2,216个差异表达基因，其中1,276个上调、940个下调。KEGG富集分析显示，植物-病原互作、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢以及MAPK信号通路四条通路显著富集。在植物-病原互作通路中，编码LRR受体样激酶的XA21和LECRK3被诱导，阳离子通道基因CNGC1显著上调，MAPK级联组分MKK4和转录因子WRKY22被诱导，下游防御基因IOS1和PR蛋白基因PRB1强烈上调。在植物激素信号通路中，甘露聚糖独特地激活了乙烯（ETH）、BR、JA和SA四条通路。SA通路中NPR1、TGA10和病程相关基因PRB1/PR1的诱导表明系统获得性抗性（SAR）的建立，这与β-葡聚糖主要激活BR和JA通路形成对比。在碳水化合物代谢方面，甘露聚糖处理显著下调了纤维素水解限速酶β-葡萄糖苷酶基因BGLU42和BGLU18，上调了蔗糖合酶基因ROQ1、RPV1和转化酶基因，这些转录变化有利于葡萄糖积累，增强能量供应以支持防御反应。在MAPK信号通路中，FLS2-BAK1受体复合物诱导后，下游MMK2和MKK4上调，信号放大导致WRKY33强烈上调（log2FC = 5.1）以及WRKY22和WRKY65上调，最终增加PRB1和IOS1等防御基因表达，同时上调ROS相关信号。MAPK信号通路作为核心枢纽，整合了植保素相关防御代谢、抗性基因激活、ROS调控和植物激素介导的防御反应。
四、讨论与结论
β-葡聚糖和甘露聚糖虽同源于马克斯克鲁维酵母细胞壁，且均能有效诱导果实抗性，但转录组分析揭示它们激活了不同的调控通路。β-葡聚糖主要激活BR和JA信号通路以及Ca2+-MAPK-WRKY免疫模块，而甘露聚糖则激活更广泛的激素防御谱（ETH、BR、JA、SA），并特异性调控碳水化合物代谢和MAPK级联信号。这些差异可能与其结构特征和单糖组成有关，影响寄主受体的识别和下游防御信号的触发。因此，酵母细胞壁的抗性诱导效力可能取决于其主要多糖组分的相对丰度和结构组织，而非单一的通用机制。
本研究证明，与酿酒酵母相比，马克斯克鲁维酵母细胞壁具有更强的增强梨果实对扩展青霉侵染抗性的能力，显著降低蓝霉病发生率。增强的生防效果归因于其独特的生化组成——葡聚糖、甘露聚糖和几丁质的特定比例——以及独特的孔状结构。施用马克斯克鲁维酵母细胞壁可引发协调的防御反应，包括启动氧化爆发、提高关键抗氧化酶和防御相关酶活性、通过GABA支路刺激γ-氨基丁酸积累。转录组分析进一步阐明，其组分β-葡聚糖和甘露聚糖协同激活核心防御通路，包括植物激素信号转导和植物-病原互作。值得注意的是，甘露聚糖还通过调控碳水化合物代谢为防御反应提供能量，并通过MAPK信号级联放大抗性。这些发现确立了马克斯克鲁维酵母细胞壁作为一种强效且有科学依据的食品级采后病害管理激发子。未来研究应聚焦于优化其制剂和应用方案，并在更广泛的水果-病原体系中验证其效力，以推动其发展为传统化学杀菌剂的实用且可持续的替代方案。该论文发表在《Food Innovation and Advances》。
